Двое биологов из Лестерского университета (Великобритания) построили оригинальную программируемую систему конфокальной микроскопии, способную выдавать изображения с частотой, которая определяется скоростью работы камеры.

Преимуществом конфокальных микроскопов, напомним, называют повышенное разрешение формируемых ими флюоресцентных снимков биологических образцов. В традиционной микроскопии качество изображения снижается из-за того, что флюоресценция, излучаемая слоями, расположенными выше и ниже фокусной плоскости, регистрируется вместе с основным сигналом, а в конфокальном варианте методики «нежелательную» флюоресценцию отсекает специальная диафрагма с малым отверстием.

Фотографию всего образца обычно получают путём сканирования — перемещения лазерного источника, возбуждающего флюоресценцию, от точки к точке и сбора света, проходящего сквозь отверстие.

Несложно догадаться, что постепенное сканирование ограничивает скорость работы микроскопа, лишая учёных возможности наблюдать за скоротечными клеточными процессами. Чтобы ослабить это ограничение, вместо одиночного отверстия используют щелевые диафрагмы, несколько ухудшающие разрешение, или целые массивы отверстий и детекторов. В последнем случае массив часто размещают на быстро вращающемся диске Нипкова, при установке которого весь образец можно облучать практически мгновенно.

Хотя применение диска Нипкова не отражается на качестве снимков, такая модификация конфокального микроскопа требует мощных лазеров (при высокой мощности можно не обращать внимания на то, что бóльшая часть излучения, падающего на диск, не достигает образца) и плохо поддаётся регулировке. Диаметры отверстий и расстояния между ними фиксированы и подбираются для какой-то конкретной числовой апертуры линзы объектива; если экспериментатор захочет что-то поменять, ему обязательно придётся извлекать диск и вставлять другой, а потом заново настраивать всю систему.

Рис. 1. Сверху: схема цифрового микрозеркального устройства с разделением на блоки сканирования, содержащие p2 «отверстий», которые, в свою очередь, формируются из n2 зеркал. Разные значения n и p соответствуют разным конфигурациям, на рисунках обозначаемым в формате n×p. Снизу: влияние величин n и p на разрешение и контраст снимков флюоресцентных сфер диаметром в 6 мкм. (Здесь и далее иллюстрации из журнала PLoS ONE).

Постепенно в область конфокальной микроскопии проникают новые технологии. На смену вращающимся дискам Нипкова, к примеру, приходят их твердотельные неподвижные аналоги — цифровые микрозеркальные устройства (digital micromirror device, DMD), традиционно используемые в DLP-проекторах. Эти устройства представляют собой массивы крошечных зеркал, которые соответствуют пикселам в проецируемом изображении и, отклоняясь в ту или другую сторону, управляют прохождением света. Во флюоресцентной микроскопии они могут играть и роль пространственного модулятора света, задающего схему облучения образца, и (в конфокальном случае) роль массива отверстий, фильтрующих возвращаемый образцом сигнал, с изменяемыми диаметром и схемой расстановки.

Поскольку зеркала DMD переходят из одного положения в другое с очень высокой скоростью, соответствующие способы формирования снимков также считались потенциально быстрыми.

Намереваясь оценить их возможности, британцы изготовили свою версию микроскопа на основе DMD с разрешением 1024×768 и провели серию экспериментов с различными источниками света: лазером на ионах аргона, ртутной лампой, светодиодами. Излучение, испускаемое образцами, при этом передавалось на ПЗС-камеру с электронным умножением не через систему линз, а посредством вогнутых, выпуклых и плоских зеркал, что увеличило эффективность сбора света и обеспечило совпадение снимков, получаемых на разных длинах волн.

Рис. 2. Слева показаны «обычные» снимки, сделанные новым микроскопом, а справа — фотографии, выполненные по методике конфокальной микроскопии. А — пыльца растения из семейства тыквенных (длины волн возбуждения флюоресценции — 470 ± 20 и 560 ± 20 нм, длины волн собираемого излучения — 500–540 и 600–670 нм), В — нейрон улитки Lymnaea stagnalis.

Как показали измерения,

новый конфокальный микроскоп делает более 30 снимков высокого разрешения в секунду, а в отдельных случаях (при наблюдении ярких образцов) на формирование одного изображения уходит лишь 10 мс. Кроме того, пользователь может настраивать систему под конкретные задачи, изменяя размеры «отверстий» (групп зеркал, пропускающих излучение) и блоков сканирования, охватывающих все возможные положения какого-то одного «отверстия».

«Я думаю, мы создали прототип действительно полезного прибора, — резюмирует один из двух участников исследования Николас Хартелл (Nicholas Hartell). — Есть хорошая возможность довести его до стадии коммерческого продукта, который можно будет увидеть в лабораториях по всему миру».