Соматические мутации ДНК опухолевых клеток могут быть использованы как высоко специфические биомаркеры для дифференциации раковых и нормальных клеток. Такие ДНК биомаркеры могут использоваться для диагностики, прогноза, лечения и последующего наблюдения за состоянием пациентов.

Биологи из Национального центра научных исследований (Centre national de la recherché scientifique, CNRS), Национального института здравоохранения и медицинских исследований (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Inserm), Парижского университета имени Декарта (Université Paris Descartes) и Страсбургского университета (Université de Strasbourg), Франция, разработали метод, дающий возможность обнаруживать малейшие следы опухолевой ДНК, присутствующие в биологических жидкостях пациента. Метод заключается в проведении сверхчувствительного молекулярного анализа в микроскопических каплях. Успешно протестированный на генах, вовлеченных в развитие различных видов рака, включая рак толстого кишечника и лейкемию, он обладает потенциалом стать мощным инструментом в руках врачей-онкологов как при постановке диагноза, так и при назначении лечения. Клинические испытания метода начнутся в ближайшее время.

Работа опубликована на сайте журнала Lab on a Chip.

Геномная ДНК разделена на пиколитровые капли с концентрацией меньше одного геномного
эквивалента на каплю вместе с двумя маркерами TaqMan® , один из которых специфичен
для мутантной, а другой для ДНК дикого типа, вызывающими зеленый и красный флуоресцентные сигналы,
соответственно. Соотношение мутантных и дикого типа генов определяется путем подсчета
соотношения зеленых и красных капель. (Рис.pubs.rsc.org)

Когда опухолевые клетки погибают, их содержимое попадает в межклеточную среду. ДНК этих клеток затем обнаруживается в биологических жидкостях организма: крови, лимфе, моче и т. д. Так как развитие большинства видов рака связано с генетическими факторами, простой анализ крови или мочи может теоретически выявить присутствие опухолевой ДНК и, таким образом, рак, как только погибнут первые опухолевые клетки – другими словами, на очень ранней стадии развития заболевания.

Но на пути получения такой ценной информации стоит серьезное препятствие: врачи пока не могут отследить рак в биологических жидкостях, так как ДНК опухолевых клеток присутствует в них в следовых количествах. В крови, например, она составляет менее 0.01% от всей растворенной в ней ДНК. Традиционные методы анализа ДНК не достаточно чувствительны для обнаружения таких небольших количеств. Поэтому интерес к методу, разработанному учеными CNRS, Inserm, Парижского университета Декарта и Страсбургского университета в сотрудничестве с немецкими исследователями из Института Макса Планка (Max Planck Institute) в Геттингене и американской компанией Raindance Technologies полностью оправдан. Его существенным преимуществом является то, что по сравнению с методами, используемыми в клиниках в настоящее время, он снижает порог обнаружения ДНК в 20000 раз.

На чем же основан метод? Первый шаг заключается в разделении ДНК, извлеченной из биологического образца, на миллионы капелек, каждая из которых достаточно мала, чтобы содержать только один ген-мишень. Затем число копий этой ДНК увеличивается с помощью современных методов молекулярной амплификации. Одновременно с ДНК взаимодействуют флуоресцентные молекулы, специфичные для каждого из генов. Эта ключевая фаза создает своего рода генетический цветовой код. Затем капли, одна за другой, направляются в микроскопические канавки, где они анализируются с помощью лазера: цвет флуоресцентных молекул указывает на то, какой ген находится в данной капле. Например, если капля излучает красное свечение, ДНК здорова. Если она светится зеленым, это опухолевая ДНК. Если капля не флуоресцирует, значит, она не содержит целевого гена. Концентрацию опухолевой ДНК легко определить путем простого подсчета цветных капель.

Разработанный французскими учеными метод позволяет определять специфический дисбаланс мутантных аллелей в нескольких раковых клеточных линиях и получать точную количественную оценку мутантного гена KRAS в присутствии 200000-кратного избытка не мутантных генов KRAS. Чувствительность ограничена только количеством анализируемых капель. Более того, путем поочередного слияния содержащих геномную ДНК капель с любым из семи различных типов капель, содержащих специфичный для различных мутаций KRAS и гена дикого типа биомаркер TaqMan® , и оптического кода возможно проведение скрининга шести распространенных мутаций в кодоне 12 KRAS параллельно в одном эксперименте. (© Jean-Christophe Baret, MPI-ds)

Ученые успешно применили свой метод на онкогене (гене, способном вызвать рак), известном как KRAS, связанном с лейкемией, раком толстого кишечника, поджелудочной железы и легких. ДНК, несущая этот ген, была получена из лабораторных клеточных линий. Теперь этот аналитический метод должен быть проверен в терапевтическом контексте. Клинические испытания уже запланированы. В случае успеха врачи получат эффективное «противораковое оружие», не только выявляющее присутствие опухолей, но и облегчающее назначение соответствующего лечения. Агрессивность раковой опухоли, особенности ее реакции на существующие лекарственные препараты и степень риска рецидива после проведенного лечения  – вся эта информация частично содержится в опухолевой ДНК. Ее расшифровка с помощью технологии микрокапель обеспечит онкологов мощным диагностическим инструментом, прогнозирующим дальнейшее развитие заболевания и определяющим стратегию его лечения.

Аннотация к статье

Quantitative and sensitive detection of rare mutations using droplet-based microfluidics