У нас было четыре центрифуги, тысяча пипеток Пастера, наборы реактивов, морозилка на минус двадцать, термоциклер, форезная камера и трансиллюминатор, который включался, только если нажать off. [пост на geektimes.ru, NNN] Единственное, что вызывало сомнения, — как мы будем делать ПЦР в полевых условиях, но мы знали, что рано или поздно мы попробуем и это.

Мы сделали это впервые на московском ГикПикнике 13–14 июня в парке Красная пресня. Расставили столы, рассадили волонтеров, наварили агарозного геля в микроволновке из нашего офиса (получались прекрасные брикеты прозрачного, как слеза младенца, холодца для электрофореза) и начали генотипирование. Хотелось показать всем, что генетика — это весело!

Команда компании «Атлас» делала генотипирование DRD4 — гена рецептора дофамина, известного как гормон удовольствия. Ген DRD4 отвечает за то, чтобы клетки нашего мозга «ощущали» присутствие дофамина. Конец этого гена образован повторяющимися участками. Количество повторов может быть разное — от 2 до 11. Соответсвующим образом будут нумероваться аллели: 2R, 4R, 7R и т.д. В зависимости от количества повторов в гене, белок будет реагировать на дофамин сильнее или слабее. Это влияет на интенсивность чувства удовольствия от событий или еды и, как следствие, на уровень азарта человека. Людям с семикратным повторением (7R-полиморфизмом) нужно больше дофамина для достижения удовлетворения, им вряд ли будет достаточно вкусняшек или подобных им простых удовольствий. Часто им приходится ради этого отправляться в путешествия, заниматься рискованными видами спорта — им вообще не сидится на месте. Это подтверждают исследования, которые выявили связь между аллелем 7R и дальностью миграции древних людей из Африки по Евразии.

Для определения полиморфизма, нужно было выделить ДНК, провести полимеразную цепную реакцию (ПЦР), а её результаты прогнать на электрофорезе: устроить гонки отрезков гена DRD4 в агарозном холодце. Но обо всем по порядку.

На этапе выделения ДНК из слюны могли принимать участие все желающие. Сначала нужно было сделать соскоб с внутренней стороны щеки с помощью ватной палочки и прополоскать её в пробирке с водой.

Затем мы покатали пробирку в центрифуге, и под действием центробежной силы эпителиальные клетки осели и образовали осадок. Воду выливаем, а в пробирку для разрушения стенок клетки добавляем лизисный буфер (детергент) и греем на водяной бане.

В результате в пробирке вместо целых клеток оказывается смузи, как из блендера: остатки мембран, цитоплазма с растворенными в ней белками, клеточные органеллы и ДНК. Излекаем её в три приёма.

Первый этап основан на полярности. Все молекулы разделяются на две группы — полярные (то есть, имеющие заряд) и неполярные (без всяких зарядов на поверхности). Полярные молекулы любят полярные растворители (так соль растворяется в воде), а неполярные молекулы растворяются только в неполярных жидкостях (эфирные масла — в спирте).

Поэтому мы добавляем в пробирку неполярный растворитель хлороформ (ДНК в нем не растворяется, а клеточные мембраны — да) и отправляем центрифугировать.

В результате мы получаем двухфазный раствор: вода с пленкой ДНК наверху и опустившийся на дно хлороформ. Нужно аккуратно вытянуть пипеткой Пастера водную часть с ДНК и переложить в другую пробирку, а хлороформ вылить. К чести гиков скажем, что даже самые юные ребята отважились провести эту ювелирную операцию.

Затем мы добавили осадочный раствор для того, чтобы еще раз отмыть ДНК от детергентов.

ДНК — заряженная частица, поэтому для её осаждения мы добавили раствор соли с большой ионной силой. (В какой-то момент он у нас закончился, пришлось бежать на фуд-корт, занимать обычную поваренную соль и разводить её). Под занавес — шоковая терапия: добавляем ледяной 96% этанол. Десять минут в морозилке, десять тысяч кругов в центрифуге — и мы можем видеть ДНК на дне пробирки.

Сливаем жидкость, а сам осадок растворяем в деионизированной воде. Такая вода не нарушает работу ферментов, которые используются в молекулярной биологии, поэтому её можно использовать для ПЦР.

Всё остальное проходило в нашем лабораторном шатре (читай — в чистом поле).

С помощью ПЦР мы получали множество копий участка самого конца нашего гена.

Два праймера определили начало и конец участка с повторами гена DRD4. Вырезали его и многократно скопировали, используя фермент полимеразу, воспроизводящую последовательность нуклеотидов по образу и подобию изначально имеющегося отрезка гена. Этот процесс называется амплификацией. Это всё происходило автоматически в специальном амплификаторе.

Для определения полиморфизма мы провели электофорез — те самые гонки, о которых мы уже говорили. Наш эксперт молекулярный биолог Вера Башмакова капала в лунки агарозного геля получившиеся после ПЦР образцы.

Потом через гель пропускали электрический ток. Заряженные молекулы ДНК двигались в электрическом поле, и скорость их перемещения зависела от числа повторов в гене: чем их больше, тем отрезок ДНК медленнее. В гель мы добавили специальный раствор, который подсвечивал ДНК, если просветить гель ультрафиолетом на трансиллюминаторе. Расстояние замерили маркером молекулярного веса — и вуаля, у вас определился авантюрный «медленный» аллель 7R.

Весь анализ занимал около двух часов (без учета процесса выделения ДНК).

Всего за два дня пикника генотипирование прошли около 150 человек, из которых генетических авантюристов было 13%. При этом в среднем для российской популяции вариант 7R встречается всего у 5% людей. Получается, концентрация генетических авантюристов на ГикПикнике повышена.

Кстати, один из авантюристов субботы так увлекся полевой генетикой, что пришел к нам в воскресенье уже как волонтер :)