На модели рака молочной железы мышей американские и английские ученые применили систему «молекулярных штрих-кодов», позволившую проследить судьбу различных клонов первичной гетерогенной раковой опухоли и понять их роль в развитии заболевания. Одни клоны остаются в первичной опухоли и способствуют ее росту, другие выявляются в основном в метастазах. Авторы описали ключевые механизмы формирования псевдососудистой системы в первичной опухоли и проникновения через эту систему раковых клеток в кровоток как важнейший этап формирования метастазов. Полученные данные непременно будут проверены на раках других типов и могут оказаться очень полезными для разработки антиметастазных противораковых средств.

Рис. 1. Клональный анализ опухоли 4Т1 с помощью «молекулярных штрих-кодов» и трансплантации. В клетки опухоли 4Т1 с помощью ретровирусного вектора вводили in vitro набор «молекулярных штрих-кодов» — различных коротких ДНК. «Кодированные» клетки затем трансплантировали мышам. После того как сформировались опухоли и метастазы, собирали различные органы и ткани, и с помощью секвенирования определяли в них количественные соотношения различных штрих-кодов, которые несли потомки различных клеток анализируемой опухоли. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Метастазы раковых опухолей являются главной причиной гибели пациентов при онкологических заболеваниях. Метастазирование представляет собой сложный многоступенчатый процесс, в ходе которого клетки первичной опухоли проникают в кровеносные или лимфатические сосуды и распространяются по организму. Затем они покидают сосуды и формируют метастазы (вторичные опухоли) в других, порой очень отдаленных органах и тканях. Изучение процесса метастазирования до настоящего времени было затруднено главным образом из-за отсутствия адекватных задаче модельных систем.

На модели рака молочной железы мышей группа ученых из университетов США и Великобритании разработала элегантную систему индивидуальных «молекулярных штрих-кодов» — по аналогии с хорошо известными штрих-кодами, которыми метят товар в супермаркете для автоматического распознавания на кассе. Новая технология позволяет помечать различные клоны клеток гетерогенной опухоли: в клетки вводится набор различных коротких последовательностей ДНК, не влияющих на функционирование клетки, что позволяет в дальнейшем сравнительно легко найти и определить потомков этих клеток. Молекулярные штрих-коды помогли проследить судьбу различных клонов в формировании опухоли и метастазировании.

Рис. 2. Анализ функциональных свойств индивидуальных клонов опухоли 4Т1. Клетки опухоли 4Т1 «кодировали» так же, как и в первом эксперименте. Из полученной популяции выделяли отдельные клетки и выращивали из них индивидуальные клоны, которые затем характеризовали, смешивали и трансплантировали мышам. Органы и ткани анализировали так же, как описано выше. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Ученые применили этот метод к мышиной опухолевой клеточной линии 4Т1 — легко поддающейся трансплантации мышам клеточной линии очень агрессивного рака груди, быстро растущего и самопроизвольно метастазирующего (см. B. A. Pulaski & S. Ostrand-Rosenberg, 2001. Mouse 4T1 breast tumor model). Метки вводились in vitro с помощью ретровирусного вектора (рис. 1). «Кодированные» клетки трансплантировали в молочные железы мышей и через 24 дня собирали образцы первичных опухолей, крови, легких, печени, мозга и подмышечных лимфатических узлов. С помощью секвенирования ДНК количественно оценивали набор кодов и, следовательно, набор клонов-потомков индивидуальных клеток опухоли в различных органах и в крови.

Оказалось, что количественное соотношение кодов клеток в первичной опухоли сильно отличается от набора кодов клеток, циркулирующих в крови. Следовательно, клетки некоторых клонов опухоли активнее проникают в кровоток. В то же время наблюдалось существенное перекрывание кодов циркулирующих клеток и метастазов. Но между циркулирующими клетками и метастазами, с одной стороны, и клетками, колонизующими подмышечные лимфатические узлы, с другой стороны, существенного перекрывания не отмечалось. Это соответствует клиническим наблюдениям о том, что у 20–30% больных раком молочной железы с отдаленными метастазами подмышечные лимфатические узлы были свободны от раковых клеток. Таким образом, популяция клонов клеток 4Т1 адекватно воспроизводит на мышах различные аспекты прогрессии заболевания раком молочной железы.

В следующей серии экспериментов «кодированные» клетки подвергали клеточному сортингу (cell sorting — процедура, позволяющая получить из популяции отдельные клетки в соответствии с их свойствами), после чего выращивали их клоны. В результате авторы смогли достаточно детально охарактеризовать свойства различных клонов клеток первичной опухоли. Клоны росли с разной скоростью, клетки имели различную морфологию. После подращивания клоны объединяли, вводили в молочные железы мышей и проводили анализ, как в первой серии экспериментов (рис. 2). Через 14 дней профиль клонов первичной опухоли был примерно таким же, как у смеси, подращиваемой in vitro. Но через 24 дня опухоль характеризовалась доминированием уже только одного из клонов — 4Т1-I. Введение мышам клеток изолированного клона 4Т1-I также приводило к ускоренному росту опухоли. Поэтому его взаимодействие с другими клонами при формировании опухоли не обязательно.

Кроме того, были идентифицированы и изучены отдельные клоны, которые были сравнительно слабо представлены в первичной опухоли, но доминировали в кровотоке, а часть из них обнаруживалась в метастазах. Они тоже отличались от клонов, колонизующих лимфатические узлы. Клон 4Т1-Т, доминирующий в метастазах, сформировавшихся через кровоток, при индивидуальном введении активнее других формировал легочные метастазы. Таким образом, оказалось, что различные клоны клеток гетерогенной опухоли обладают резко отличающимися способностями доминирования в первичной опухоли, проникновения в кровеносную или лимфатическую системы, инициирования метастазов.

Затем авторы изучили отличия в экспрессии генов в различных клонах клеток первичной опухоли. Они нашли, что клоны, эффективно проникающие в кровеносную систему, усиленно экспрессируют два белка — Serpine2 и Slpi, являющихся антикоагулянтами (то есть препятствующих свертыванию крови). Важным оказался тот медицинский факт, что усиленная экспрессия их человеческих ортологов SERPINE2 и SLPI при раке молочной железы связана с образованием метастаз в легких и в мозге. Искусственное подавление у мышей экспрессии Serpine2 и Slpi значительно ограничивало способность клонов инициировать метастазы.

Дальнейшие эксперименты показали, что Serpine2 и Slpi необходимы и достаточны для программирования клеток на создание в опухоли подобия сосудистой системы (vasculogenic mimicry, рис. 3). «Подобия» — потому что роль эндотелия, выстилающего внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, выполняют в ней сами клетки опухоли, которые формируют внутриопухолевую сеть «псевдососудов» и связывают ее с кровеносной системой. Кроме того, антикоагулянты Serpine2 и Slpi способствуют проникновению раковых клеток в кровеносную систему и переносу их в отдаленные органы и ткани.

Рис. 3. Сеть «псевдососудов» в опухоли способствует метастазированию. При образовании метастазов раковые клетки первичной опухоли проникают в сеть «псевдососудов», а через нее попадают в кровеносную систему и выходят в отдаленных органах и тканях. Клоны клеток, секретирующих белки-антикоагулянты Serpine2 и Slpi (зеленые), участвуют в формировании сети «псевдососудов» и позволяют различным клеткам опухоли (зеленые, синие, фиолетовые) через кровеносные сосуды мигрировать к местам формирования метастазов. Рисунок из синопсиса к обсуждаемой статье в Nature

Таким образом, авторы разработали и применили новую информативную систему для изучения роли различных клонов гетерогенной раковой опухоли в развитии заболевания, а также описали ключевые механизмы проникновения раковых клеток в кровоток как важнейшего этапа формирования метастаз. Дальнейшие исследования покажут, насколько описанная модель применима для других типов рака и возможно ли использование SERPINE2 и SLPI как мишеней для разработки новых противораковых средств.

Источники:

1. Elvin Wagenblast et al.A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis // Nature. 2015. V. 520. P. 358–362.
2. Mary J. C. Hendrix. An extravascular route for tumour cells // Nature. 2015. V. 520. P. 300–302. (Популярный синопсис к обсуждаемой статье.)

Автор: Вячеслав Калинин