Американские ученые усовершенствовали методику микроскопии, основанную на физическом увеличении размеров образцов мозга. В нынешнем виде она позволяет визуализировать структуры, формирующие синапс, с помощью обычного светового микроскопа. Описание метода приводится в журнале Nature Methods.

Визуализация с помощью световой микроскопии ограничена дифракционным пределом до максимального разрешения приблизительно в 300 нанометров. Чтобы преодолеть это ограничение, сотрудники Массачусетского технологического института и Гарвардского университета недавно разработали методику микроскопии растяжения (expansion microscopy, ExM). Она состоит в том, что образец ткани мозга обрабатывают набором антител и флуоресцентных белков, помечающих интересующие ученых структуры, после чего этот образец пропитывают гелем из полиакриламида, фиксирующего положение меченых биомолекул, и механически гомогенизируют.

3D-визуализация образца мышиного гиппокампа, растянутого в 16 раз. Jae-Byum Chang et al. / Nature Methods, 2017

При погружении в воду гель равномерно увеличивается примернов 4,5 раза от первоначального объема, зафиксированные в нем структуры также увеличиваются пропорционально. Это повышает разрешение световой микроскопии примерно до 60–70 (~300/4,5) нанометров. Тем не менее, для визуализации формирующих синапсы структур (например, шипиков дендритов — мест контакта саксонами других нейронов) этого недостаточно.

Чтобы дополнительно повысить разрешающую способность метода, тот же научный коллектив предложил проводить подготовку образца в две стадии. Первая стадия выполняется так же, как оригинальная ExM с использованием полимеризующего гель состава, который впоследствии можно удалить. Вторая стадия проводится аналогично первой, только в ней в качестве исходного образца используется уже растянутый гель с мечеными молекулами, который перед повторным растяжением вымывают.

Принцип действия методики. Jae-Byum Chang et al. / Nature Methods, 2017

Полученный образец хорошо подходит для объемного сканирования световым микроскопом в силу своей прозрачности — он примерно на 99,99 процента состоит из воды и полимера.

Такая методика, получившая название микроскопии итеративногорастяжения (iterative expansion microscopy, iExM), позволяет увеличить образецеще примерно в 4,5 раза, что соответствует приблизительно 20-кратномурастяжению от первоначального объема. Благодаря этому разрешающая способностьсветовой микроскопии позволяет рассматривать структуры с изначальным размеромоколо 25 нанометров.

В эксперименте метод iExM позволил визуализировать и провести трехмерную реконструкцию устройства синапсов и ветвления дендритов нейронов различных структур мышиного мозга (в частности, гиппокампа и бледного шара) и проследить за отдельными нейронными цепями в них, для чего у обычной световой микроскопии и ExM недостаточно разрешения.

Методики изучения нервной ткани постоянно совершенствуются. Так, например, нейробиологи научились искусственно создавать нейронные ансамбли, печатать аналоги мозговой ткани на 3D-принтере, восстанавливать утраченные нейрональные связи светом и сохранять их при заморозке образцов, а также наблюдать за эпигенетической регуляцией работы мозга в реальном времени.

Трехмерное моделирование коннектома во фрагменте крысиного гиппокампа позволило пересмотреть классификацию синапсов и датьновую оценку информационной емкости мозга — по мнению ученых, она превышает петабайт, что примерно соответствует объему всей информации в интернете.

Также современные методики визуализации и работы с данными позволили исследователям построить полную модель коннектома дрозофилы и создать атлас человеческого мозга с микронным разрешением.

Автор: Олег Лищук