Ученые из США разобрались в активной структуре человеческого ORC комплекса, который связывается с точкой начала репликации и инициирует удвоение клеточной ДНК в процессе деления. Проведенное исследование помогает понять, каким именно образом образуется связь между ДНК и ORC, как в этом процессе используется АТФ и почему мутации в субъединицах ORC комплекса приводят к болезням человека. Полный текст исследования опубликован на сайте журнала eLife, а кратко о его содержании рассказывает пресс-релиз лаборатории Колд Спринг Харбор.

Когдав жизни клетки настает этап деления, возникает необходимость передать полный набор генетической информации каждому своему потомку, никого при этом не обделив. Для этого на основе имеющейся ДНК создается ее точная копия. Этот процесс называют репликацией, а синтезом ДНК занимается фермент ДНК-полимераза.

Известно, что ДНК состоит из двух цепей. Самым важным в каждой цепи является последовательность четырех разных азотистых оснований: аденина, тимина, гуанинаи цитозина, которые по первым буквам принято обозначать А, Т, Г и Ц. Эти «буквы» собираются в «строчки», в которых записана вся информация. При этом, когдав одной цепи стоит А, на второй обязательно будет Т, анапротив Г — Ц. И наоборот. Это называют комплементарностью, и такое положениедел позволяет построить вторую цепь, имея в своем распоряжении только одну.

Схематичное трехмерное изображение структуры человеческого ORC комплекса без CDC6. Субъединица ORC1 окрашена в зеленый, ORC2 – в бежевый, ORC3 – в оранжево-розовый, ORC4 – в голубой, ORC5 – в фиолетовый. Ante Tocilj el al., eLIFE Research article

Во время репликации специальные ферменты расплетают двойную спираль и разводят ее нити встороны, создавая репликационную вилку. Дальше ДНК-полимераза использует материнскую цепь как шаблон и скрупулезно ставит напротив имеющихся нуклеотидов положенные им пары. Так на основе каждой из двух цепей возникает еще по одной.

Таким образом, в каждую клетку отправляется полноценная двуцепочечная ДНК, в составе которой естьодна цепь, принадлежавшая материнской клетке, а вторая достроена по ее образу и подобию.

Репликация генома инициируется в строго определенных местах генома (одном или нескольких), которые называются точками начала репликации (origin of replication или просто origin). Если геном небольшой, то можно обойтись одной, но у эукариот их, как правило, гораздо больше. Перед репликацией обеспечивающие ее ферменты занимают исходные позиции, а потом синхронно приступают к делу. Каждый работает на своем участке, темсамым обеспечивая быстрое удвоение даже значительных объемов генетической информации.

Громадную роль в инициации репликации играет распознающий точку начала репликации комплекс —ORC (origin recognition complex), который самособирается на ней и служит основой для сборки следующего, т.н. пререпликационного комплекса. ORC довольно консервативен у всех эукариот и состоит из шести частей — субъединицы с первой по шестую. Несмотря на очевидную его важность и открытие, состоявшееся больше двадцати лет назад, о структуре человеческого ORC было известно довольно мало. Новое исследование, проведенное методами рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии, устраняет этот пробел.

ORC можно условно разделить на две части. Первая состоит из ORC2 и ORC3, а во вторую входят субъединицы ORC1, ORC4 и ORC5 и образуют самую интересную его часть — «моторный отсек» комплекса. Соединение этих двух частей придает комплексу почти кольцевидную форму, а последующее связывание с белком CDC6 превращает конструкцию в полноценное кольцо, через центр которого проходит ДНК.

Как говорят сами авторы работы, структура «моторного отсека» человеческого ORC больше всего напоминает орешек кешью.

Схематичное трехмерное изображение структуры «моторного отсека» комплекса ORC. Субъединица ORC1 окрашена зеленым цветом, ORC4 – голубым, ORC5 – фиолетовым. Три молекулы АТФ показаны стрелками и располагаются между субъединицами ORC1/ORC4, ORC4/ORC5 и на поверхности субъединицы ORC5. Ante Tocilj el al., eLIFE Research article

Как и любому двигателю, «моторному отсеку» ORC требуется топливо, а им в клетке является АТФ —аденозинтрифосфат (АТР — аdenosinetriphosphate). АТФ представляет из себя аденин, связанный с рибозой, ккоторой по цепочке присоединены три фосфатные группы. В связях между этими группами заключена энергия, и гидролизируя их клетка может извлечь ее для своих нужд. В случае ORC это случается, например, во время присоединения белка CDC6. Особенно важно, что в новой работе ученым удалось «поймать» комплекс в его активной фазе и разобраться, как именно АТФ взаимодействует с «моторным отсеком».

Полученные данные также помогают лучше разобраться в причинах, вызывающих синдром Мейера-Горлина, который проявляется карликовостью и микроцефалией. Известно, что этот синдром развивается при нарушениях в работе репликативного комплекса и в том числе связан с мутациями в «моторном отсеке» ORC. Ученые проанализировали испорченные мутациями субъединицы «моторного отсека» и показали, что повреждение первой полностью уничтожает АТФазную активность, а повреждение четвертой лишь незначительно ее снижает. Повреждение же обеих приводит к сходному с повреждением первой эффекту, что указывает на их роль в использовании АТФ.

Интересен, эффект, который вызывают мутации при синдроме Мейера-Горлина. Повреждение ORC1 так же приводит к исчезновению активности и приводит к самой тяжелой форме синдрома. Но когда изменения затрагивают ORC4, «моторный отсек» наоборот становится гиперактивным. Однако, при соединении с остальными частями комплекса, эффективность его работы все же снижается вполовину от нормальной, что тоже плохо сказывается на организме-носителе, но не так критично. Проясненные детали помогают понять, как и почему возникает синдром Мейера-Горлина.

В целом оказалось, что человеческий ORC заметно отличается от аналогичного у дрозофилы, но похож на комплекс дрожжей. Однако, несмотря высокое сходство они по-разному взаимодействуют с ДНК — во время деления дрожжей комплекс стабилен, а у человека он постоянно собирается и разбирается.

Не так давно изучение процесса репликации принесло еще одно открытие. Дело в том, что ДНК-полимераза не может начать синтезировать вторую цепь сама по себе, чтобы начать ей требуется праймер, затравка — небольшой кусочек последовательности, комплементарный основной цепи. Его синтезирует праймаза, но тонкая регуляция взаимодействия между этими ферментами до сих пор оставалась неясна. Оказалось, что два фермента общаются, передавая по цепочке ДНК электрон.

Автор: Юрий Солюс