Исследователи из Альбертского университета создали фоторасщепляемый белок, который позволяет контролировать внутриклеточные процессы с помощью излучения фиолетового света. Статья опубликована в Nature Methods.

Фоточувствительные белки часто применяются в биологических исследованиях, например, при изучении мозговой активности. Соответствующая методология называется оптогенетикой. Три основные категории уже имеющихся оптогенетических инструментов — фотоактивируемые каналы и насосы, созданные на основе бактериальных опсинов, белки, подверженные фотозависимой аллостерической регуляции и белки, способные к фотозависимым реакциям в контексте олигомерных изменений. Фоторасщепляемый белок стал четвертой категорией в этом списке. Он создан на основе фотопереключаемого из зеленого в красный флуоресцентного белка FP mMaple. При облучении светом ~400 нм в этом белке происходит реакция β-элиминирования, в результате которой его хромофор удлиняется, при этом полипептидная цепочка разрезается на два фрагмента в ~66 и ~166 аминокислот, которые, несмотря на разрыв, не отделяются друг от друга. Белок вместо зеленого света начинает излучать красный.

Wei Zhang et al. / Nature Methods

Ученые придумали другую модель на основе FP mMaple – при фотопереключении новый белок должен будет распадается на совсем маленький пептидный фрагмент, длиной около ~10 аминокислот, и большой фрагмент, называемый «пустая бочка», длиной приблизительно в 220 аминокислот, которые после этого спонтанно отделятся друг от друга. Для получения такого конструкта было создано шесть генных библиотек, в каждой из которых содержалось 400 вариантов гена, кодирующих похожие на FP mMaple белки с небольшими вариациями. Чтобы выбрать подходящие для дальнейшей работы варианты, их внедрили в бактериальные колонии и выбрали из них те, которые при облучении фиолетовым светом cначала переключались с зеленого излучение на красное, а затем совсем темнели, что подразумевало диссоциацию пустой бочки. Оптимальный вариант улучшили методом ускоренной эволюции, получив за счет восьми новых мутаций большую эффективность формирования хромофора, фотопереключения и диссоциации пептидов, что сделало и зеленое, и красное излучение более яркими и уменьшило время перехода в темную фазу.

Полученный в результате фоторасщепляемый белок PhoCl сохраняет целостность в темноте, но распадается на два фрагмента при облучении фиолетовым светом. Для того, чтобы оценить эффективность его применения, ученые провели ряд экспериментов. В одном из них они брали метку, позволяющую белкам проникать в клеточное ядро, и присоединяли ее к некоторому исследуемому белку через связку с PhoCl. В темноте белок попадал в ядро, а на свету метка диссоциировала вместе с пустой бочкой, и он уже не мог проникнуть сквозь ядерную оболочку без нужного для этого «пропуска». В другом эксперименте PhoCl подключали как связующее звено между регулятором транскрипции Gal4-VP16 и его ингибитором – стероидным рецептором. При облучении PhoCl распадался, регулятор транскрипции обретал свободу и принимался за работу, в результате чего повышалась экспрессия соотвествующих генов.

Ранее мы рассказывали, как флуоресцентные свойства молекул могут позволять следить, например, за ходом химиотерапии у пациентов. С помощью фоторасщепляемого белка можно будет активировать и изучать самые разные процессы внутри дрожжей, бактерий, человеческих клеток и даже целых животных, считают исследователи.

«Мы предлагаем новый способ изучения клеточной биологии, — заявил один из руководителей проекта, профессор кафедры химии Роберт Кэмпбелл, — я вижу в этом методе огромный потенциал для целого спектра исследовательских проектов – от изучения пути между клеткой и тканью в биологии развития до расширения возможностей геномного редактирования».

Автор: Анна Казнадзей