Исследователи показали, что использование системы CRISPR/Cas в клетках млекопитающих с достаточно высокой вероятностью приводит к возникновению больших делеций и даже геномных перестроек в результате работы клеточных систем репарации. В отличие от предыдущих опасений о том, что система вносит нецелевые мутации, в данном случае указанные перестройки были обнаружены именно в том месте, куда был направлен CRISPR. Работа с выводами ученых опубликована в Nature Biotechnology, а в редакционной заметке Nature можно ознакомиться с комментариями специалистов по этому поводу.

Система редактирования генома CRISPR/Cas содержит два ключевых компонента: нуклеазу из семейства Cas, которая вносит в ДНК разрыв, и направляющую РНК, «указывающую» нуклеазе, где именно ей резать. Образующийся разрыв залечивается клеточными системами репарации при помощи гомологичной рекомбинации с использованием шаблона, в роли которого может выступать соседняя хромосома, либо при помощи негомологичного соединения концов, когда разорванная ДНК соединяется «как попало». В клетках млекопитающих чаще используется второй сценарий, в результате реализации которого, как правило, образуются небольшие делеции или мутации.

Ранее исследователи, проверяющие место разрыва (место «посадки» CRISPR) секвенированием, докладывали, что размер делеций, которые остаются после его репарации, может достигать максимум нескольких сотен пар нуклеотидов. В новой работе британские ученые из Института Сэнгера (Wellcome Sanger Institute) под руководством Алана Брэдли (Allan Bradley) показали, что размер таких делеций может достигать тысяч нуклеотидов. Более того, результатом репарации разрыва могут стать перестройки в ДНК, такие как транслокации (перенос кусков с других хромосом), инверсии (разворот кусочка ДНК в обратную сторону) и большие вставки.

Схематичное изображение прочтений заданного генетического локуса (PigA) при помощи платформы PacBio. Michael Kosicki, Kärt Tomberg & Allan Bradley / Nature Biotechnology 2018

Авторы исследования работали на трех клеточных линиях — эмбриональных стволовых клетках мыши, мышиных клетках кроветворения, выделенных из костного мозга, и иммортализованой клеточной линии человека. В определенный генетический локус они «направляли» CRISPR при помощи соответствующей направляющей РНК, чтобы выключить ген, а затем секвенировали весь локус (несколько тысяч пар оснований) в отдельных клонах с мутациями при помощи платформы PacBio, которая позволяет прочитывать без остановки длинные фрагменты ДНК. Наличие больших делеций и перестроек предварительно детектировали следующим образом: направляющую РНК подбирали к некодирующему участку репортерного гена (интрону), и если ген выключался, значит в результате разрыва происходила крупная перестойка, затрагивающая кодирующие участки гена.

На всех клеточных линиях ученые обнаружили, что частота больших делеций (например, две тысячи пар оснований) составляет около пяти процентов при наличии второй копии гена на гомологичной хромосоме и до 20 процентов при ее отсутствии (в случае с половыми хромосомами). Помимо делеций ученые детектировали встройки «лишней» ДНК — к примеру, в одном из проверенных клонов в место разрыва встроился большой фрагмент матричной РНК, кодирующей совсем другой ген. При этом выпадения больших кусков ДНК или перестойки чреваты нарушением работы соседних генов и увеличивают вероятность злокачественного перерождения клеток.

Конечно, тот факт, что разрывы в ДНК, особенно двуцепочечные, увеличивают число хромосомных перестоек, сам по себе не является сюрпризом для ученых. Однако в данной работе исследователи показали, что помимо наличия нецелевых мутаций, редактирование генома может привести к нежелательным мутациям в нужном месте («он-таргетные» мутации) с достаточно большой вероятностью, причем это касается не только CRISPR, но и других систем. Учитывая, что в некоторых медицинских приложениях, таких как редактирование иммунных клеток человека ex vivo (вне организма с последующим возвращением туда), редактированию подвергаются очень большие количества клеток, число клеток с нежелательными мутациями среди них может оказаться довольно велико.

Несмотря на то, что «контроль качества» работы CRISPR проводили в большом количестве работ, как правило, это делается при помощи секвенирования коротких участков в месте посадки нуклеазы и потенциальных сайтах нецелевого редактирования. Более того, даже при секвенировании генома из-за особенностей технологии прочтения такие события, как инверсии, можно не заметить. Поэтому авторы работы указывают на необходимость более тщательного контроля результатов редактирования, например, при помощи непрерывного секвенирования больших локусов.

Ранее основной опасностью CRISPR как инструмента редактирования генома человека считали большое количество нецелевых мутаций из-за неточного связывания направляющей РНК. Так, ученые при помощи полногеномного секвенирования нескольких мышей подсчитали, что количество таких мутаций может быть очень велико. Однако впоследствии эту работу отозвали из журнала из-за ряда допущенных в ней методических ошибок. Множество работ, описывающих например, редактирование эмбрионов человека или обезьян при помощи CRISPR, не выявили значимого количества нецелевых мутаций.

Автор: Дарья Спасская