Нобелевская премия по химии в 2018 году была присуждена за разработку методов направленной эволюции ферментов, пептидных последовательностей и антител. Награду разделят между собой Фрэнсис Арнольд (Frances H. Arnold), Джордж Смит (George P. Smith) и сэр Грегори Винтер (Sir Gregory P. Winter). Фрэнсис Арнольд получила премию за разработку метода направленной эволюции ферментов, а два других ученых — за создание метода фагового дисплея пептидов и антител.

Методы, за разработку которых присудили Нобелевскую премию по химии в 2018 году, используются для синтеза в лабораторных условиях различных типов белков с нужными свойствами — каталитической активностью, способностью связываться с теми или иными веществами и клетками или диапазоном условий, в которых эти белки работают. Оба разработанных подхода основаны на том, что структура белков, которые синтезируются в живых организмах, кодируется последовательностью нуклеотидов в генах. С помощью механизмов транскрипции и трансляции последовательность нуклеотидов на определенном участке молекулы ДНК преобразуется в последовательность аминокислот, в результате чего синтезируется белок с определенной первичной структурой, который принимает нужную форму и выполняет в организме те или иные функции.

Соответственно, если слегка нарушить последовательность нуклеотидов в ДНК, изменив пару азотистых оснований, то можно повлиять и на структуру белков, которые они кодируют, изменив при этом их физические и химические свойства. В естественных условиях подобные изменения в последовательности нуклеотидов происходят за счет случайных мутаций — изменений генома под влиянием внешних условий, например за счет ошибок во время репликации ДНК. Именно эти ошибки приводят к эволюции живых организмов: в структуре гена накапливаются небольшие изменения, после чего естественным образом отбираются наиболее выгодные с точки зрения дальнейшего развития вида варианты.

В процессе естественной эволюции выбор наиболее эффективных белков и соответствующих им генов может занимать очень длительное время, охватывающее жизнь множества поколений. Но для того, чтобы аналогичный подход можно было использовать для направленного синтеза белков с заданными свойствами в лабораторных условиях, его хочется проводить намного быстрее. Изначально для направленного синтеза белков на основе ДНК ученые пытались вносить изменения в структуру молекулы в известных местах на основе теоретических предсказаний. Однако как именно точечные замены азотистых оснований повлияют на функции белка, предсказать заранее практически невозможно, поэтому такой подход оказался не слишком эффективным.

Направленная эволюция

В 1993 году Фрэнсис Арнольд предложила альтернативный подход. Она показала, что изменение структуры гена, отвечающего за синтез определенного белка, можно проводить не точечно, а наоборот — получая множество вариантов гена с небольшими изменениями в случайных местах. Сейчас для этого чаще всего используют полимеразную цепную реакцию с повышенной вероятностью мутаций — процесс многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью ДНК-полимеразы. В результате этого процесса образуется множество копий исходного гена, и структура многих из них из-за случайных мутаций совсем незначительно отличается от структуры исходной молекулы. Все эти гены кодируют практически такой же белок, как и ДНК с изначальной последовательностью нуклеотидов, однако его свойства все же немного отличаются. В наборе всех этих многочисленных модификаций — библиотеке генов — содержатся молекулы, которые кодируют как более эффективные ферменты, так и менее эффективные.

Основная трудность после создания такой библиотеки — отобрать из нее именно те гены, которые соответствуют наиболее эффективным — с точки зрения дальнейшего применения — белкам. Для этого было предложено использовать сравнительно маленькие библиотеки, которые поэтапно обогащались «полезными» вариантами за счет отбора после каждого раунда мутагенеза. Этот процесс, по сути, повторяет эволюцию, и на каждом этапе отбирается тот ген, который кодирует более эффективный белок.

«Вы до некоторой степени играете в Бога и в эволюцию, — комментирует этот подход Константин Северинов, профессор Сколтеха и университета Ратгерса. — Эволюция по Дарвину тоже происходит совершенно ненаправленно, все изменения случаются без оглядки на результат, случайно, а потом отбор находит в имеющемся разнообразии то, что нам нужно в данной ситуации. В эксперименте вы просто резко увеличиваете скорость накопления мутаций, а дальше отбираете как вам хочется».

Теоретическую возможность подобного метода еще в 1984 году предсказал Манфред Эйген (тоже Нобелевский лауреат), однако реализовать его в эксперименте впервые удалось именно Фрэнсис Арнольд в 1993 году. В своей работе она синтезировала субтилизин E — фермент из класса гидролаз. В результате четырех стадий мутагенеза ей удалось увеличить его активность в 250 раз по сравнению с изначальной модификацией.

Предложенная методика включала в себя следующие основные стадии. Сначала определяются те ферменты, которые лучше всего подходят для возможной эволюции. Затем для них составляются библиотеки генов, после чего разрабатываются критерии, по которым определяется нужная динамика характеристик фермента (например, Арнольд смотрела, насколько быстро протекает гидролиз казеина под действием фермента). Те ДНК, которые производят «хорошие» белки, сохраняются, а те, которые приводят к синтезу ферментов с ухудшенными свойствами, — выкидываются. Затем отобранные ДНК подвергаются следующей стадии мутагенеза, и создается новая библиотека. Повторяя эту процедуру несколько раз, можно добиться получения фермента с требуемыми свойствами.

Принципиальная схема метода направленной эволюции ферментов. Nobel Prize

«Фактически Арнольд предложила способ, позволяющий проводить в лаборатории резко ускоренную эволюцию молекул ДНК. Раньше люди, когда клонировали ДНК, размножали молекулы в пробирке, пытались делать эти модификации как можно точнее, чтобы увеличить количество исходного гена и не дай бог его не изменить, — говорит Северинов. — Фактически она пришла к идее, что это нужно делать не очень точно, а, наоборот, немножко неточно, и тогда у вас будет материал для эволюции. Если у вас есть некий белок, с определенным набором физических или биологических свойств, которые вы хотели бы улучшить, то вы можете не ждать милости у природы, а попытаться сделать это самостоятельно». Ферменты, искусственную эволюцию которых исследовала в своих работах Арнольд, — это белки, регулирующие скорость синтеза или разложения тех или иных соединений в клетке, отвечающие за перенос химических групп от одной молекулы к другой. При этом не обязательно ускорять реакцию, которую катализирует фермент, — можно, например, увеличивать устойчивость белка при различных температурах или селективность при синтезе оптических изомеров. Таким образом, разработанный Арнольд подход помог не только усовершенствовать метод синтеза биокатализаторов с заданными свойствами, но и в целом исследовать процесс видоизменения белков в процессе эволюции — зависимость свойств белков от внешних условий, скорости мутагенеза, размера популяций или жесткости отбора.

У такого метода есть, однако, одно очевидное ограничение. «С помощью него вы не можете нормально работать с белками, которые вы не умеете растить в бактериях, — говорит заведующий лабораторией молекулярных технологий Института биоорганической химии РАН Всеволод Белоусов. — Если белок простой, бактерия его может синтезировать: он в ней правильно свернется и будет в бактерии работать. Например, флуоресцентный белок — маленький „бочонок“ из бета-слоев. Свернулся — и все. Нет вариантов. Поэтому он легко эволюционирует. Например, мы подобным образом делаем биосенсоры на разные молекулы, потому что в этом случае можно экспрессировать этот белок внутри бактерии E. Coli. Однако если это, например, эукариотический белок, да еще и мембранный, либо у него какая-нибудь посттрансляционная модификация, которой нет в бактериях, то в таком случае направленная эволюция практически невозможна. Только если есть какой-то компьютерный метод или после долгого и внимательного изучения структуры в результате попыток точечных модификаций».

Структура фермента для реакции циклопропанирования, который удалось синтезировать с помощью метода направленной эволюции. P. S. Coelho et al./ Nature Chemical Biology, 2013

Использование вирусов

Кроме ферментов, которые помогают быстро провести те или иные химические реакции, похожим образом можно получать и другие белки, необходимые, например, для производства лекарств. В этом контексте внимание ученых привлекают другие соединения, которые есть в живых организмах, — антитела. Это белки, продуцирующиеся B-лимфоцитами при попадании в организм бактерий или вирусов. Антитело связывается с эпитопами — пептидами или сахаридами на поверхности бактерий или вирусов — и подавляет таким образом их размножение или нейтрализует выделяемые ими токсические вещества. Правильно подобрать антитело для конкретных веществ — тоже непростая задача, но ее можно решить похожим образом, с помощью направленной эволюции.

Сейчас для этого чаще всего используется метод фагового дисплея. Впервые его предложил Джордж Смит, который для синтеза антител, способных специфично связываться с нужным антигеном, использовал бактериофаги — вирусы, которые заражают бактерии. Внутри вирусов содержится молекула ДНК, а оболочка состоит из белков, структура которых этой ДНК кодируется. В 1985 году ученый показал, что если к гену белка оболочки присоединить последовательность, кодирующую другой белок в одной рамке считывания, то этот белок окажется на поверхности фаговой частицы. Ученый также показал, как область появления новой пептидной последовательности зависит от места в гене, в которое встраивается новая нуклеотидная последовательность.

Принципиальная схема метода фагового дисплея. Nobel Prize

Спустя пять лет после первой работы Смита Грегори Винтер продемонстрировал, что этот метод можно использовать, например, для получения на поверхности бактериофага антитела, способного селективно связываться с нужным антигеном. Для этого в определенное место ДНК вируса встраивается ген, который кодирует нужный участок антитела, необходимый для распознавания антигена. Тогда в поверхностном белке появляется нужный пептидный участок, и вирус, таким образом, сам фактически превращается в антитело. После этого можно проводить процедуру направленной эволюции: встраивать в ДНК случайные мутации, создавать библиотеку вирусов и в результате отбора увеличивать эффективность антител.

В качестве примера использования такого подхода Всеволод Белоусов приводит такой пример: «Допустим, вы хотите получить белок, который связывает молекулу NADH, но при этом не связывает NADPH. Для этого вы берете поверхность и покрываете ее молекулой NADH. На нее вы наливаете смесь фагов, полученных бактерией E. Coli. В ней очень много разных модификаций. Каждый фаг уникален и несет на себе свой вариант исследуемого белка. Все то, что связалось, прилипло к поверхности, а все, что не связалось, вы можете отмыть. Потом в более жестких условиях вы отмываете то, что связалось, и секвенируете ген — это то, что вы хотите изучать».

По словам Констатина Северинова, метод фагового дисплея — самый быстрый способ получить антитела, обладающие наилучшей способностью связываться с раковыми клетками. «Например, у вас уже есть некое антитело, и вы хотите увеличить его эффективность в тысячу раз. Для этого вы берете ген антитела, вставляете его в вирус, чтобы белок был на поверхности, и получаете библиотеку вирусов. После этого вы проверяете ее во все более и более сложных условиях: снижаете число раковых клеток, с которыми нужно связаться, добавляете агент, который нарушает связывание. Вы выбираете те вирусные частицы, которые оказались самыми „крепкими“ в условиях проводимого вами отбора. Дальше вы можете выяснить, как отличаются частицы, которые прошли этот функциональный скрининг от тех, которые не прошли. В результате можно получить последовательность, не существующую в природе, но имеющую нужные нам свойства».

Благодаря методу фагового дисплея сейчас фактически можно направленно синтезировать любые белки с измененными свойствами и использовать их для лечения аутоиммунных заболеваний или рака.

Настоящее методов направленной эволюции

Разработанные методики направленной эволюции и фагового дисплея давно стали рутинными. «Сейчас даже перестаешь думать о том, что у них может быть автор, как у какой-нибудь теоремы Пифагора, — говорит Северинов. — Все работают с этим, это действительно каждодневная лабораторная практика».

На настоящий день эти методы используют для получения биотоплива, при разработке лекарств, получении ферментов, необходимых для синтеза соединений, которые невозможно получить классическими методами органического синтеза. «Работы профессора Фрэнсис Арнольд помогли при помощи ферментов сделать качественные прорывы в большом количестве синтезов, достижения Грегори Винтера и Джорджа Смита позволили существенно продвинуться в синтезе белков и новых фармацевтических препаратов, в том числе протовораковых. Речь идет о направленной модификации с целью получения новых веществ, образования химических связей, которых в природе могло и не быть, — говорит исполняющий обязанности декана химического факультета МГУ Степан Калмыков. — Такие изменения могут приводить к появлению новых свойств организма — увеличению продолжительности жизни, устойчивости к болезням, эволюционным изменениям. Это действительно революция в области изучения ферментов, последствия которой имеют колоссальное прикладное значение в медицинской и медико-биологической области. Это и адресная доставка лекарств, и изменение биохимии организма. Результаты этой работы могут коснуться каждого человека на Земле».

Автор: Александр Дубов