Китайские ученые существенно повысили эффективность выращивания взрослых мышей с геномами от двух матерей, но без отцовского. Также впервые им удалось получить живых мышат от двух отцов. Этого удалось достичь за счет использования эмбриональных стволовых клеток и выключения определенных участков в их геноме, работающих по-разному в зависимости от того, от какого родителя они получены. Исследование опубликовано в журнале Cell Stem Cell.

Партеногенез — форма размножения, при которой половые клетки развиваются во взрослый организм без оплодотворения вообще, или без слияния ядра сперматозоида с ядром яйцеклетки после оплодотворения (такой вариант называется гиногенез). Такой процесс встречается у нескольких десятков видов животных, в том числе и позвоночных (ящериц, амфибий, рыб, птиц). Чаще всего таким способом размножаются самки, однако показаны подобные случаи и у самцов некоторых рыб. Для млекопитающих случаев партеногенеза в природе пока не известно. Случаев, когда жизнеспособное потомство заводят однополые родители, также пока не наблюдалось.

В данном проекте ученые работали с феноменом геномного импринтинга. Это эпигенетический процесс, в результате которого ген работает по-разному в зависимости от того, получен он от отца или от матери. Наследование соответствующих признаков поэтому происходит не по классическому менделевскому принципу. Например, аллель гена IGF2 (инсулиноподобного фактора роста) работает в том случае, если он унаследован от отца. Унаследованный от матери такой же аллель работать не будет. Импринтинг осуществляется за счет метилирования ДНК в промоторной области выключаемого гена, в результате чего его транскрипция блокируется. В геноме такие гены чаще всего расположены группами (импринтинговые участки хромосомы). У млекопитающих их известно около ста.

Одной из основных теорий, объясняющих феномен геномного импринтинга, является теория родительского противостояния. Она подразумевает, что у родителей есть разные «цели» в контексте эволюционной приспособленности и продолжения рода. Гены отца «стремятся» увеличить успех потомства, в том числе за счет здоровья матери во время беременности и после. Гены матери, напротив, «стремятся» сохранить материнские ресурсы для того, чтобы она выжила и обеспечила жизнеспособность не только этого, но и следующих поколений.

Взрослая мышь с геномами двух матерей, давшая собственное живое потомство. Li et al, Cell Stem Cell

Разница между геномами отца и матери, в том числе, касающаяся геномного импринтинга, лежит в основе барьеров, препятствующих однополому размножению, и стимулирует взаимовыгодный обмен генетической информацией между разнополыми особями, а также способствует распространению полезных мутаций в популяции и поддержанию конкурентноспособности у потомства.

Еще в 2004 году другой группе исследователей уже удавалось получить мышат от двух матерей без отца, используя незрелые яйцеклетки и выключая в добавляемых к ним геномах участок подвергающегося импринтингу гена H19. Одна такая мышь даже выросла во взрослую особь и оказалась способна давать собственное потомство. 

На данный момент, отмечают ученые, ясно, что многие аспекты, определяющие барьеры, связанные с однополым размножением, пока что не известны. Так, появляются все новые данные о генах, подверженных импринтингу, которые пока не дают полной картины происходящего. 

В данном проекте ученые брали ДНК из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) — это клетки, полученные из бластоцисты на ранней стадии развития эмбриона (5–6 дней после оплодотворения, такой эмбрион состоит из 50–150 клеток). ЭСК плюрипотентны — они могут развиться во все типы клеток взрослого организма. Их можно подвергать культивированию, в том числе, в гаплоидной форме (гаЭСК), когда в клетке сохраняется ДНК только от одного из родителей.

Выяснилось, что гаЭСК по своим свойствам подходят в качестве доноров ДНК. Они гипометилированы, то есть их ДНК в гораздо меньшей степени метилирована, чем ДНК яйцеклеток, сперматозоидов и фибробластов. Больше всего их тип метилирования напоминал первичные половые клетки, гоноциты, которые появляются на 10,5 день развития эмбриона. При более подробном анализе конкретных участков генома ЭСК выяснилось, что в их случе, действительно, можно говорить об отсутствии импринтинговых эффектов.

Схема получения эмбриона с геномами двух матерей. Li et al, Cell Stem Cell

За счет инъекции в незрелые яйцеклетки гаЭСК с выключенными с помощью технологии CRISPR-Cas9 импринтинговыми участками H19 и IG (как оказалось, мышата гораздо успешно выживали, если участки были оба выключены) удалось получить жизнеспособных мышат от двух матерей. Однако такие мышата имели существенные дефекты развития, кроме того, они двигались медленнее и могли преодолевать меньшие расстояния по сравнению с диким типом. Сравнительный анализ работы генов их мозга и мозга мышей дикого типа выявил разницу в работе трех генов, подверженных импринтингу — Th, Xlr3b и Rasgrf1. Они отвечали за малую активность, когнитивную деятельность и память.

Удивительным являлся тот факт, что экспериментальные мыши при этом прожили дольше мышей дикого типа. Сравнительный анализ факторов, влияющих на метаболизм, выявил снижение работы гена lgf1, который у людей является фактором, отрицательно влияющим на продолжительность жизни. Кроме того, у партеногенетических мышей оказался снижен уровень холестерина.

В новом эксперименте ученые в дополнение к H19 и IG выключили также и область гена Rasgrf1. В результате из 210 эмбрионов выжили целых 29 (14 процентов – по сравнению с работой 2004 года это более чем десятикратное увеличение эффективности метода). Общие уровни метилирования генома у таких мышат были схожи с контрольными, и все их импринтинговые гены экспрессировались нормально. Работа гена lgf1 также соответствовала норме.

Мышей, полученных от двух матерей, скрестили с нормальными мышами, в результате чего родилось в общей сложности 22 мышат (из 6 выводков). Девять мышат (с выключенными по-отдельности участками H19 или IG) умерли, а остальные 13 выросли во взрослых особей.

Для эксперимента с двумя отцами понадобилось выключать большее количество участков. В предыдущих работах уже было показано, что эмбрионы с ДНК двух отцов умирали на гораздо более ранних стадиях по сравнению с экспериментами с ДНК самок. Ученые выбрали шесть импринтинговых участков (Nespas, Grb10, Igf2r, Snrpn, Kcnq1, Peg3), выключили их у мужских гаЭСК и провели ко-инъекцию таких геномов вместе со сперматозоидами в безъядерные яйцеклетки. Из 1144 эмбрионов, однако, ни один не смог вырастить плаценту и не выжил.

Схема получения эмбриона с геномами двух отцов. Li et al, Cell Stem Cell

В качестве альтернативной стратегии ученые сделали диплоидные ЭСК, чтобы создать тетраплоидные эмбрионы, в надежде, что у них сможет развиться нормальная плацента. Всего было сделано 1023 эмбриона, из которых 12 (1,2 процента) родились живыми. Вскоре после рождения они, однако, умерли. Их вес был в два раза выше обычного и они обладали другими дефектами развития, в том числе страдали водянкой и не могли нормально дышать и сосать молоко.

Сравнение размеров тела на срезах мыши дикого типа и мышат от двух отцов с 6 и с 7 выключенными участками. Li et al, Cell Stem Cell

Оказалось, что у таких мышей наблюдалось гипометилирование участка Gnas и соответствующий ген плохо экспрессировался. Исследователи выключили еще один участок, относящийся к этому гену (он входил в область Nespas) и создали 477 эмбрионов с уже 7 выключенными участками. Живыми родились 12 мышат (2,5 процентов), их вес и прочие признаки были значительно ближе к дикому типу. Двум мышатам, у которых признаки водянки полностью отсутствовали, удалось прожить двое суток.

Мышонок от двух отцов, родившийся живым. Li et al, Cell Stem Cell

Анализ метилирования геномов таких мышей выявил, что, хотя в целом оно тоже оказалось сходно с диким типом, ряд импринтинговых участков у экспериментальных мышей был недостаточно метилирован, и соответствующие гены (например, Cdkn1c, Sgce, Plagl1, Zim1, Calcr и Asb4) экспрессировались не так, как у дикого типа. Очевидно, в разрешении этой проблемы лежит ключ к дальнейшим экспериментам.

Отдельно ученые отмечают, что тот факт, что два материнских генома снижали вес мышонка, а два отцовских его повышали, по их мнению, поддерживает теорию «родительского противостояния», поскольку на выращивание крупного эмбриона и, впоследствии, мышонка, мать потратит гораздо больше собственных ресурсов, а мелкое потомство обеспечит больше шансов выжить ей самой.

Автор: Анна Казнадзей