Исследователи смогли исправить точечную мутацию, приводящую к развитию фенилкетонурии, в ДНК клеток печени у взрослых мышей, в результате чего мыши вылечились. Для этого ученые модифицировали «редактор оснований» на основе белка Cas9 таким образом, чтобы его ген можно было доставить в печень при помощи вирусного вектора. Как предполагают авторы публикации в Nature Medicine, этот подход можно использовать для терапии множества наследственных заболеваний у взрослых людей.

Система редактирования генома CRISPR-Cas9 уже не раз была опробована для лечения наследственных заболеваний на животных моделях. Однако принцип редактирования «классической» версией Cas9 основан на том, что белок вносит разрез, который затем залечивается с участием системы гомологичной рекомбинации ДНК. Эта система активна в делящихся клетках, но многие ткани и органы взрослого организма содержат преимущественно покоящиеся клетки, в которых CRISPR-редактирование работает плохо. Сюда относятся, в частности, клетки печени, а недостаточность печеночных ферментов в результате точечных мутаций лежит в основе целой группы наследственных заболеваний.

Чтобы исправлять мутации в клетках с высокой эффективностью, можно доставлять туда так называемые «редакторы оснований», сделанные на базе неактивной нуклеазы (например, dCas9), которая связывается с ДНК, но не разрезает ее. Функции редактирования здесь выполняют ферменты-дезаминазы, «пришитые» к нуклеазе (подробнее о том, как устроены «редакторы оснований», можно прочитать здесь и здесь). «Редакторы» могут без всяких разрезов менять, например, «буквы» GC на TA, и наоборот. Однако такие составные белки очень большие и их терапевтическое применение ограничено уже возможностями доставки ДНК (точнее, кодирующих их генов) в ткани. Самыми популярными векторами для доставки, к примеру, в печень, остаются адено-ассоциированные вирусы, однако их «емкость» довольно мала.

В новой работе ученые из Высшей технологической школы Цюриха применили «редактор оснований» для исправления мутации в гене PAH, приводящей к развитию фенилкетонурии, в печени у взрослых мышей. Фенилкетонурия обусловлена недостаточностью печеночного фермента фенилаланин-гидроксилазы (PAH), которая катализирует превращение фенилаланина в тирозин. В результате накопления фенилаланина у больных наблюдается ряд неврологических симптомов, в том числе умственная отсталость и судороги. Мутация в мышином гене PAH, приводящая к замене С на Т в 835 позиции тоже приводит к развитию подобных симптомов у мышей, поэтому такие мыши считаются хорошей моделью для изучения фенилкетонурии. Более того, восстановление активности фермента на мышах легко отслеживать, потому что у больных животных наблюдается недостаток меланина, в результате чего они не черные, а желтые.

Для того, чтобы доставить огромную генетическую конструкцию, кодирующую «редактор», в печень, ученым пришлось разделить белок на две части и добавить к каждой половинке кусок последовательности интеина, отвечающего за «белковый сплайсинг». При слиянии половинок последовательность интеина восстанавливается, и он выщепляется, сшивая куски «редактора» в целый белок. Конструкцию, кодирующую отдельную половинку, упаковали в отдельный вирусный вектор, который должен был доставить ее в печень.

Несмотря на то, что такая сложная схема должна была значительно снизить эффективность редактирования, эксперимент на клетках показал сравнимую эффективность редактирования. Более того, у мышей, которым ввели высокую дозу вирусных частиц, через шесть недель концентрация фенилаланина в крови снизилась в 20 раз до физиологического значения менее 120 микромоль. Эффективность редактирования ДНК в клетках печени составила в среднем 10 процентов через четыре недели после введения вирусов и 25 процентов через 26 недель, а оценка эффективности по последовательности мРНК показала даже цифру в 63 процента. Активность фермента при этом восстановилась в пределах 2–23 процента от нормы, а у мышей восстановился «здоровый» черный фенотип. Авторы работы заключили, что «редакторы оснований» в такой форме хорошо подходят для исправления мутаций в клетках с ограниченным потенциалом деления.

В прошлом году мы рассказывали про попытку редактирования ДНК в клетках печени взрослого человека при помощи нуклеазы с «цинковыми пальцами». В составе вирусных частиц в печень нескольких пациентов с синдромом Хантера планировалось доставить как нуклеазу, так и нормальную копию гена, которая должна была встроиться в место разреза. Недавний предварительный отчет показал, что эффективность такого подхода оставляет желать лучшего.

Автор: Дарья Спасская