Американские ученые при помощи фермента для редактирования генома под названием мегануклеаза успешно выключили в печени обезьян ген PCSK9, *контролирующий уровень липопротеинов низкой плотности в крови. Частичное выключение гена привело к снижению концентрации ЛПНП и связанного с ними «плохого» холестерина в крови животных. Этот подход, таким образом, можно рассматривать как перспективное средство для облегчения состояния людей с высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний, пишут авторы в своейстатье в *Nature Biotechnology.

Несмотря на резко возросшую в последние годы популярность CRISPR/Cas в качестве средства редактирования генома человека, предшественники этой системы также активно тестируются в качестве потенциальных терапевтических агентов. К примеру, ферменты мегануклеазы узнают и разрезают очень длинную последовательность ДНК (14–40 нуклеотидов). Такой длинный сайт узнавания значительно снижает возможность нецелевого разрезания генома. Кроме того, в отличие от Cas9, чтобы разрезать ДНК, мегануклеазам не нужна РНК-затравка. С другой стороны, если Cas9 при помощи РНК-гида можно направить к любому месту в геноме, мегануклеазы способны распознавать одну-единственную последовательность, под которую они «заточены».

В своей работе ученые из отдела генной терапии Медицинской школы Перельмана университета Пенсильвании (США) продемонстрировали на примере макак-резусов способность специально спроектированной мегануклеазы на основе эндонуклеазы I-CreI эффективно разрезать ДНК при доставке in **vivo. Двуцепочечный разрыв, который вносится ферментом, залечивается клеточной системой репарации с образованием небольших делеций или вставок. Если эти делеции образуются в кодирующей последовательности гена, это приводит к его поломке.

В качестве мишени исследователи выбрали ген *PCSK9, *который экспрессируется в печени и кодирует белок, контролирующий концентрацию липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в плазме крови. Эта фракция липопротеинов связывает холестерин и формирует отложения на стенках артерий. Известно, что высокая активность *PCSK9 *коррелирует с гиперхолестеролемией и предрасположенностью к коронарной болезни сердца, а низкая — наоборот, снижает концентрацию ЛПНП и риск развития сердечно-сосудистых заболеваний.

Авторы новой работы модифицировали эндонуклеазу I-CreI из водоросли Chlamydomonas reinhardtii при помощи компьютерного моделирования и направленной эволюции фермента так, чтобы она узнавала консервативный у макаки и человека участок гена *PCSK9. *Два полученных варианта *мегануклеазы M1PCSK9 и M2PCSK9 в составе адено-ассоциированного вируса вкололи в кровь шести макакам. После введения вируса животных наблюдали вплоть до года, у всех стабильно снизился уровень экспрессии *PCSK9 *на 30–84 процента в зависимости от дозы вектора. *При этом концентрация холестерина, связанного с ЛПНП, снизилась на 50–60 процентов.

Снижение ЛПНП в плазме крови после введения вектора с первым (слева) и вторым (справа) вариантами мегануклеазы против гена PCSK9. Lili Wang et al / Nature Biotechnology 2018

Кроме того, у животных брали биопсию печени, чтобы проверить наличие трансгенной ДНК и РНК. На 17 день после введения вируса в 70–80 процентах гепатоцитов наблюдалась экспрессия трансгена, при этом на 129 день она практически исчезла. Существенного иммунного ответа на введенный трансген у животных не наблюдалось. Первое в своем роде небольшое клиническое испытание на людях для редактирования ДНК в клетках печени в прошлом году запустила компания Sangamo Therapeutics — мы рассказывали об их первом пациенте Брайане Мадо. В качестве инструмента редактирования генома ученые использовали нуклеазу с «цинковыми пальцами», распознающими нужные последовательности в ДНК. Результаты испытания должны быть обнародованы только в 2021 году.

Автор: Дарья Спасская