Этим обзором мы начинаем серию статей по описанию потенциальных биомаркеров для диагностической панели старения SENS. Концепция SENS (Strategies for Engineered Negligible Senescence, стратегии достижения пренебрежимого старения инженерными методами) была предложена британским геронтологом Обри ди Грей. Идея концепции – это необходимость развития и применения технологий для борьбы со старением и возраст-зависимыми заболеваниями для «починки» накапливающихся повреждений в организме. Цель нашего обзора потенциальных биомаркеров состоит в том, чтобы создать панель SENS-диагностики старения. Зачем нужна диагностика SENS?

• Дать возможность человеку объективно оценить что происходит с его организмом в процессе старения с точки зрения SENS.
• Увидеть индивидуальные риски тех или иных типов повреждений связанных со старением.
• Оценить эффективность разрабатываемых методов омоложения. Увидеть, как как физическая активность, диеты, режим дня, пищевые добавки, лекарственные препараты действует с точки зрения стратегии замедления старения.
• Сравнить с другими диагностическими панелями старения, и дополнить их развитие.
• Предоставить данные об изменениях параметров для научных исследований.
• Принять решение о финансировании научных исследований исходя из наиболее интересных и чувствительных для себя рисков.
• Найти единомышленников для решения биологических задач, возникших в результате понимания собственного состояния организма с точки зрения SENS.

Концепция SENS включает в себя 7 разделов. Первым пунктом для рассмотрения мы выбрали дисфункцию митохондрий (или MitoSENS).

Митохондрии – это крошечные органеллы эукариотических организмов (за исключением некоторых бактерий, населяющих кишечник шиншилл), в которых вырабатывается энергия для всех биохимических процессов. Согласно самой популярной версии, митохондрии когда-то давно были самостоятельными единицами жизни, пурпурными фотосинтезирующими бактериями, но в процессе эволюции были поглощены древними микроорганизмами, археями, и стали вырабатывать для них энергию. В каждой клетке может содержаться более тысячи митохондрий, так, например, клетки мышц сердца имеют до 5000 митохондрий. Молекулярные моторы, АТФ-синтазы, встроенные во внутреннюю мембрану митохондрий, под воздействием потока протонов вращаются и синтезируют основной источник энергии – аденозинтрифосфорную кислоту, АТФ. Подсчитано, что организм взрослого человека синтезирует и расходует около 40 кг АТФ в сутки.

Митохондрии, в отличие от других органелл, имеют свои собственные 2–10 копий ДНК, мтДНК. В процессе производства энергии митохондрии генерируют токсичные «отходы» — активные формы кислорода (АФК), которые могут повреждать как прочие молекулы, так и различные клеточные структуры и, прежде всего, сами митохондрии, что может вызывать мутации в митохондриальной ДНК и негативно сказываться на общем энергетическом балансе организма. Так, имеющие делеции (выпадения участков) мтДНК способны быстро размножаться и заполнять собой клеточное пространство, вызывая саркопению и нейродегенерацию. «Испорченные» митохондрии начинают производить ещё большие количества АФК, приводя к увеличению окислительного стресса, который, в свою очередь, может стать причиной, развития различных патологий, преждевременного старения и гибели клетки.

Интересный факт, связанный с окислительным стрессом. Обнаружено, что существует четкая корреляция между уровнем насыщенности жирных кислот в мембранах и продолжительностью жизни животных: чем больше в мембране ненасыщенных кислот, тем меньше продолжительность жизни животного. Испанские биологи проследили такую последовательность, показывающую увеличение срока жизни при одновременном уменьшении содержания в мембранах докозагексаеновой ω-3 жирной кислоты: мышь → крыса → кролик → человек → кит [1].

Такую закономерность легко объяснить, ведь ненасыщенные жирные кислоты являются главными «жертвами» перекисного окисления липидов. Таким образом, липидный состав мембран клеток животных, которым свойственна более длительная продолжительность жизни, демонстрирует «золотую» середину: малое количество совсем ненасыщенных докозагексаеновых 22:6 ω-3 жирных кислот и преобладание менее ненасыщенных линоленовых 18:03 ω-3 жирных кислот, что создает тот самый баланс, обеспечивающий как защиту от воздействия АФК, так и сохранение необходимой текучести мембраны.

Кроме липидного состава мембран клеток животных, доля более термодинамически стабильных гуанина и цитозина среди всех остатков нуклеотидов мтДНК так же коррелирует с максимальной видовой продолжительностью жизни млекопитающих [2].

Создатели концепции SENS видят решение проблемы дисфункции митохондрий в переносе «резервных копий» митохондриальных генов в ядро, где они не могут быть повреждены АФК, генерируемыми в митохондриях. Таким образом, даже если исходные гены в мтДНК будут повреждены, резервные копии в ядерной ДНК будут иметь возможность поставлять белки, необходимые для поддержания нормальной работы по производству энергии. Этот подход называется аллотопической экспрессией белков. мтДНК человека содержит всего 37 генов из которых всего 13 кодируют белки, необходимые митохондриям, остальные (более 1000) белков координирующих работу митохондрий закодированы в ядерной ДНК. По мнению авторов SENS, перенос основных митохондриальных генов в ядро был осуществлён эволюцией именно с этой целью – уберечь их от повреждающего действия АФК.

Идея авторов SENS об эволюционном переносе ДНК митохондрий в ядерную с целью обезопасить мтДНК от вредных факторов и, таким образом, продлить жизнь, находит подтверждение в исследованиях, посвящённых анализу NUMT (nuclear mitochondrial DNA segment). Термином NUMT обозначаются фрагменты мтДНК, перенесённые в ядерную ДНК. Проведённый сравнительный анализ 17 видов животных с полностью секвенированными митохондриальными и ядерными геномами показал значительную положительную корреляцию между продолжительностью жизни и количеством последовательностей NUMT [3]. Теперь осталось найти инженерное решение по переносу резервных копий оставшихся 13 генов мтДНК.

Но существуют и альтернативные подходы к улучшению функции митохондрий. И один из них – трансплантация митохондрий извне. Описано успешное «подселение» чужеродных митохондрий в опытах с животными. Так, перенос митохондрий использовался в животных моделях при остром повреждении легких, сердечно-сосудистых болезнях и болезни Паркинсона. Подсаживание митохондрий может быть осуществлено несколькими способами: во-первых, прямое введение изолированных митохондрий (локальное введение), когда изолированные митохондрии вводят непосредственно в клетки поврежденного участка; во-вторых, системное введение, когда митохондрии вводят в общий кровоток, а затем они сами распределяются по организму. Полученные результаты свидетельствуют о перспективах трансплантации митохондрий при лечении ряда болезней [4].

Вместе с этим было бы логичным найти потенциальные биомаркеры для определения окислительного стресса, вызванного митохондриальной дисфункцией.

Окислительный стресс представляет собой дисбаланс между оксидантами (активными формами кислорода) и антиоксидантной защитой в организме в сторону окислителей. В клетках оксиданты активно взаимодействуют с биомолекулами (фосфолипидами, белками и нуклеиновыми кислотами). В результате эти биомолекулы необратимо повреждаются, что приводит к клеточной дисфункции и, как следствие, различным патологиям в организме и гибели клеток. Одна из наиболее популярных теорий старения, свободнорадикальная, предложенная Д. Харманом в 1950-х годах, видит в этом основной механизм старения.

Молекулы, образующиеся при окислении, могут служить в качестве биомаркеров. Их анализ используется для количественного определения окислительного стресса у людей. Высокие концентрации биомаркеров окислительного стресса определяются не только при возрастных или дегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, гипертония, диабет второго типа или несколько видов рака, но и при хронической обструктивной болезни легких, курении и проживании в неблагополучных с точки зрения экологии районах.

Одним из самых значимых биомаркеров окислительного стресса является 8-iso prostaglandin F2α (8-изопростан). 8-изопростан образуется при неферментативном окислении фосфолипидов клеточных биомембран, а именно арахидоновой кислоты. Это простагландин-подобное вещество вызывает сужение кровеносных сосудов и бронхов, снижает кровоток в почках, влияет на агрегацию тромбоцитов и, таким образом, участвует в патологии нескольких заболеваний. Нормальными показателями 8-изопростана у здоровых людей считается 11±4 пг/мл [5].

Также признанным биомаркером окисления липидов выступает малоновый диальдегид (МДА), который образуется при перекисном окислении липидов свободными радикалами и разрыве молекул полинасыщенных жирных кислот. Повышенная концентрация МДА в сыворотке крови служит маркером не только окислительного стресса, но и степени эндогенной интоксикации. Поэтому повышение концентрации МДА в плазме наблюдается у курильщиков, а также у людей, злоупотребляющих спиртными напитками. МДА образует Шиффовы основания с аминогруппами белка, в результате чего возникают нерастворимые липид-белковые комплексы (пигменты изнашивания или липофусцины). МДА определяют в образцах многих биологических жидкостей: сыворотке, плазме, моче, конденсате выдыхаемого воздуха. Концентрация МДА в сыворотке крови у здоровых людей (в норме) меньше 1 мкмоль/л [6].

При окислении аминокислот, входящих в состав белков, образуются ещё ряд потенциальных биомаркеров окислительного стресса: o-тирозин, 3-хлортирозин и 3-нитротирозин.

Физиологически в организме эндогенный тирозин образуется путем ферментативного окисления фенилаланина фенилаланингидроксилазой. o-тирозин (o-Tyr) и м-тирозин (m-Tyr) образуются при окислении активными формами кислорода фенилаланина. o-Tyr и m-Tyr не являются естественными аминокислотами и считаются биомаркерами окислительного стресса. Высокие концентрации o-Tyr и m-Tyr были обнаружены у пациентов с катарактой, а повышенный o-Tyr был найден в плазме крови и моче пациентов с диабетом второго типа. 3-Хлоротирозин (3-ClTyr) образуется в свободнорадикальных процессах, при реакции хлорноватистой кислоты (HClO, производной перекиси водорода) и п-тирозина.

Образование 3-ClTyr играет важную роль в сердечно-сосудистой системе, так как связано с развитием атеросклероза. 3-ClTyr способствует миграции клеток гладкой мускулатуры аорты человека (основного механизма образования сосудистых поражений), и повышенные уровни 3-ClTyr в условиях воспаления могут способствовать сосудистым заболеваниям. 3-нитротирозин (3-Notyr) образуется при окислительном стрессе путём нитрования тирозина агрессивным фагоцитарным белком миелопероксидазой (МПО). Такое нитрование негативно влияет на функцию белка. Более высокие концентрации 3-Notyr были обнаружены в цереброспинальной жидкости пациентов с болезнью Альцгеймера (11,4±5,4 нМ у пациентов и 1,6±0,4 нМ в группе здоровых добровольцев), а также у людей с артритом, атеросклерозом и гипертонией [5].

Также при действии АФК и HClO на белки образуются разнообразные продукты окисления белков (AOPP). Такие белки не выполняют своих функций и могут нанести значительный вред. AOPP продуцируются системой миелопероксидаза-перекись водорода. Более высокие концентрации AOPP были обнаружены в плазме или моче пациентов с острым коронарным синдромом или активным язвенным колитом. Нормальными показателями АОРР у здоровых людей считается уровень в плазме 60–70 нМ [5].

Общеизвестными биомаркерами окисления нуклеиновых кислот выступают 8-гидроксигуанозин (8-OHG) и 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин (8-OHdG). 8-OHdG является основным продуктом окисления ДНК. 8-OHG образуется при окислении РНК. Более высокая концентрация 8-OHdG обнаруживается у пациентов с болезнью Альцгеймера, артритом, атеросклерозом, катарактой, гипертонией, остеопорозом и диабетом второго типа. 8-OHdG также считается потенциальным биомаркером рака, связанного с курением (например, раком легких). 8-OHG можно обнаружить у пациентов с болезнью Альцгеймера, и было показано, что окислительное повреждение РНК выше, чем повреждение ДНК. Концентрации 8-OHdG в крови у здоровых людей составляют 1,09±0,52 нМ, уровни 8-OHG (в спинномозговой жидкости) – 97±32 пМ [5].

Ещё одним биомаркером, определяющим дисфункцию митохондрий и окислительный стресс, является количество копий клеточной мтДНК (существует ещё внеклеточная мтДНК, которая попадает в кровь при распаде клеток и её уровень увеличивается с возрастом). Так, известно, что с возрастом количество клеточной мтДНК снижается, причём у мужчин больше, чем у женщин. Более низкий показатель количества мтДНК также значительно связан с развитием старческой астении (дряхлости, frailty). Количество копий мтДНК также может быть эффективным прогностическим маркером смертности от всех причин, от сердечно-сосудистых, онкологических и респираторных заболеваний [7].

Потенциалом использования в качестве биомаркеров митохондриальной дисфункции и окислительного стресса обладают и эндогенные антиоксиданты: глутатион, цистеин, мочевая кислота и убихинол. При взаимодействии с активными формами кислорода эндогенные антиоксиданты окисляются, но затем снова восстанавливаются при помощи специальных ферментов. Поэтому в организме молекулы антиоксидантов присутствуют в двух формах: восстановленной форме (антиоксидантой) или окисленной (после реакции с оксидантами). При помощи хроматографического метода возможно фиксировать отношение восстановленных и окисленных форм антиоксидантов и таким образом определять степень окислительного стресса [8].

Биомаркеры дисфункции митохондрий и окислительного стресса:

1. 8-изопростан.
2. Малоновый диальдегид
3. O-тирозин, 3-хлортирозин, 3-нитротирозин.
4. Продукты окисления белков (AOPP).
5. 8-гидроксигуанозин (8-OHG)
6. 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин (8-OHdG).
7. Клеточная мтДНК (её количество и наличие мутированных вариантов с делециями)
8. Эндогенные антиоксиданты (глутатион, цистеин, мочевая кислота, убихинол).

Авторы обзора: Денис Одиноков, Алексей Ржешевский.

Список использованной литературы:

1. Pamplona, R., Portero_Otнn, M., Ruiz, C., Gredilla, R., Herrero, A., and Barja, G. (2000) Double bond content of phospholipids and lipid peroxidation negatively correlate with maximum longevity in the heart of mammals, Mech. Ageing Dev., 112, 169–183.
2. Lehmann G1, Segal E, Muradian KK, Fraifeld VE. Do mitochondrial DNA and metabolic rate complement each other in determination of the mammalian maximum longevity? Rejuvenation Res. 2008 Apr;11(2):409–17.
3. Muradian KK1, Lehmann G, Fraifeld VE. NUMT («new mighty») hypothesis of longevity. Rejuvenation Res. 2010 Apr-Jun;13(2–3):152–5.
4. Gollihue, Jenna L., Samir P. Patel, and Alexander G. Rabchevsky. Mitochondrial transplantation strategies as potential therapeutics for central nervous system trauma. Neural regeneration research13.2 (2018): 194.
5. Kamila Syslová, Adéla Böhmová, Miloš Mikoška, Marek Kuzma, Daniela Pelclová, and Petr Kačer. Multimarker screening of oxidative stress in aging. Oxid Med Cell Longev. 2014;562860. Published online 2014 Jul 16.
6. Яшин А., Яшин Я. Высокоэффективная жидкостная хроматография маркеров окислительного стресса. 2011. Аналитика. №1, 34–43.
7. Foram N. et al. Association of Mitochondrial DNA levels with Frailty and All-Cause Mortality. J Mol Med (Berl). 2015 Feb; 93(2): 177–186.
8. Жлоба А.А,. Субботина Т.Ф., Алексеевская Е.С., Моисеева О.М., Гаврилюк Н.Д., Иртюга О.Б. Метаболические и белковые маркеры дисфункции митохондрий у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 60 (7): 35–41.