Американские исследователи показали, что добавление небольшого элемента вторичной структуры к направляющей РНК может существенно увеличитьсточность редактирования ДНК CRISPR-системами.Как поясняют ученые в статье в Nature Biotechnology, РНК-шпилька мешает нуклеазной активности Cas-белка на «неправильных» мишенях, но не мешает в случаеточного соответствия последовательностей между направляющей РНК и мишенью.

Несмотря назначительный прорыв в области терапевтического применения CRISPR-редактирования (эти системы ужеприменяют для* ex vivo* редактирования генома отдельных клеток, например,лейкоцитов, и даже редактирования эмбрионов человека), ученых по-прежнемубеспокоит точность работы CRISPR, которая нередко проявляет нецелевую активность в человеческом геноме. Увеличитьсточность узнавания и разрезания ДНК чаще всего пытаются путем внесения мутацийв CRISPR-эффекторы, вчастности, белок Cas9. Темне менее, такой подход, хоть и привел к созданию множества вариантов Cas сувеличенной специфичностью, чаще всего приводит и к существенному снижению эффективности редактирования на нужных мишенях.

Ученые из университета Дьюка подошли к проблеме сдругой стороны и занялись настройкой РНК-компонента CRISPR. «Упрощенный» вариант CRISPR-системы, которыйиспользуют в качестве инструмента редактирования в эукариотических клетках,включает эффектор (Cas9или Cas12а) инаправляющую РНК, которая содержит 20-нуклеотидный спейсер — участок,комплементарный последовательности в геноме, которую нужно порезать. Известно,что в точность узнавания основной вклад вносит первая часть спейсера. Исследователипредположили, что если оставшийся конец спрятать внутри вторичной структуры,точность редактирования увеличится.

Charles Gersbach / Duke University

Схема образования шпильки на 5'-конце РНК-спейсера. D. Dewran Kocak et al / Nature Biotechnology 2019

Чтобы проверить гипотезу, авторы работы предсказали in silico ипоказали экспериментально, что добавление короткой последовательности, образующей с 5’-концом РНК-спейсера небольшую и не очень прочную шпильку, неснижает эффективности связывания Cas9 с мишенью, но при этом влияет на эффективность редактирования. Последний параметр проверяли на направляющих РНК против генов VEGFA иEMX1, у которых есть понесколько известных «оф-таргетов» (участков неспецифического связывания вгеноме).

Оказалось, что для таких участков шпилька значительн оснижает нежелательную активность — как по сравнению с контрольным немодифицированным спейсером, так и по сравнению с укороченным вариантом спейсера, где лишние буквы просто отрезали, и по сравнению со спейсером с довеском, не образующим шпильки. На нужном участке активность CRISPR при этом существенно не менялась (хотя вычисленияпредсказывали ее снижение). В среднем для ряда оф-таргетов увеличение точности «канонического» SpCas9 из Streptococcuspyogenes произошло в 55 раз. Увеличение точности в присутствии шпильки авторытакже увидели для других используемых на практике эффекторов — SaCas9 из Staphylococcusaureus и разных форм Cas12a.

Эффективность разных направляющих РНК на целевом локусе в гене EMX1 (ON) и нескольких нецелевых локусах (OT). WT-немодифицированный спейсер, Hairpin – РНК со шпилькой, Truncated – обрезанный спейсер. D. Dewran Kocak et al / Nature Biotechnology 2019

Обсуждая механизм наблюдаемого феномена, авторы работы предположили, что шпилька на конце спейсера ингибирует формирование комплексаРНК-ДНК (так называемой R-петли),которое необходимо для нуклеазной активности Cas-белка, в случае неточного спаривания ДНК-РНК, и такимобразом, предохраняет систему от нецелевой активности. Самое главное в таком способе увеличения специфичности — его универсальность, так как направляющая РНК используется всеми CRISPR-системами,и ее просто синтезировать.

Посмотреть своими глазами, как работает CRISPR-Cas9 вклетке, можно здесь.

Автор: Дарья Спасская