Работа посвящена исследованиям «зубного налета», а конкретно пигментированного зубного налета, средствами сканирующей зондовой микроскопии (наноуровень). Исследования проводились с использованием шлифов зубов. Ранее наноструктура зубного налета изучена мало, в литературе в основном представлена клиническая картина (может иметь мягкую или плотную консистенцию, быть различного цвета: от желтого, серого до темно-коричневого, черного). При плохой гигиене полости рта на зубах могут появляться пигментации, связанные с активностью хромогенных бактерий.

Объектом исследования является зубной налет – зубной налет (бляшка) – плотное образование, состоящее из бактерий, расположенных внутри матрицы, которая образуется за счет белков, полисахаридов, липидов и некоторых неорганических веществ (кальция, фосфатов, магния, калия, натрия и др.).

Целью исследований является получение практических и теоретических сведений о структуре и свойствах эмали, поверхностных образований на зубах (в частности зубного налета), необходимых для правильного подхода к назначению средств профилактики и лечения.

Актуальность работы обусловлена тем, что одной из причин кариеса и болезни пародонта (комплекса тканей, окружающих зуб и обеспечивающих его фиксацию в челюстной кости) является зубной налет, природа и структура которого изучены мало. Представляет на сегодня повышенный интерес как изучение механизма образования налета, так и его микро- и наноструктуры, что крайне важно для развития методик предотвращения и профилактики этих заболеваний. Полное изучение структуры зубного налета, механизма его образования помогут создать комплексные механизмы предупреждения образования зубного налета. Это поможет снизить развитие кариеса и заболеваний пародонта и способствовать созданию новых средств и препаратов для их профилактики и лечения. Решаемые задачи:

1. В рамках исследования проверяется предположение о возможности рассмотрения зубного налета как наноструктуры.
2. Проводится анализ и обобщение результатов исследования зубных отложений на наноуровне.
3. Исследование структур зубных налетов осуществляется на продольных и поперечных шлифах зубов, проводится экспертная оценка поверхности шлифов при разной степени увеличения.

«Зубной налет» – это одна из форм структурных зубных образований: 1) кутикула, 2) пелликула, 3) зубной налет (бляшка), 4) зубной камень, 5) пищевые остатки, 6) муциновая пленка и др.

«Зубной налет» – в большой степени «живое» динамичное образование; кислота, выделяемая микробами, действует на эмаль и на сам налет, что формирует постоянно меняющуюся клиническую картину. Исследования проводились путем сравнения шлифов с налетом со шлифами без налета на «мертвых зубах» с временем консервации более месяца, что накладывает свои ограничения на получаемые результаты: бляшка – скопление микроорганизмов, биохимии, образование, которое существует только в условиях «живой среды». Для того, чтобы изучить ее, нужно исследовать зуб сразу после удаления или исследуемый зуб должен находиться в среде, близкой к естественной (в слюне и при температуре 37˚С). Перед обработкой полученных результатов сканирования была изучена имеющаяся информация о зубной эмали, что позволило получить представление о том, что мы увидим на сканах шлифов.

1. Зубной налет и его клиническая картина

Так как образование зубных налетов ведет к возникновению кариеса, то рассмотрим теории возникновения кариеса в классических фундаментальных работах.

В классической литературе выделяют следующие теории «разрушения зубов»: химическая теория, химико-паразитная теория и физико-химическая теория. Каждая из теорий ставит во главу угла те или иные причины возникновения «разрушения зубов», что необходимо учитывать при рассмотрении поверхностей зубов и тонких зубных пленок как наноструктур.

В ходе исследования нами была сформулирована нанотеория развития кариеса. При наличии в полости рта углеводов микроорганизмы образуют органические кислоты и в первую очередь молочную как конечный продукт ферментации углеводов, продуцируют внеклеточный полимер глюкозы (гликан) из сахарозы. Клеточные элементы налета вместе с внеклеточными образованиями создают нанопоры (ярко выраженные межкристаллические пространства, заполненные жидкостью, характерный размер которых не превышает 100 нм), что обеспечивает проникновение внутрь слюны и жидких компонентов пищи. Однако накопление в налете конечных продуктов жизнедеятельности организмов замедляет диффузию, так как закрываются межклеточные пространства в нем. В результате этого происходит накопление органических кислот (молочная, пировиноградная, уксусная, яблочная и др.) на ограниченном участке поверхности зуба. При длительном поддержании критического уровня pH 4,5 – 5,0 происходит растворение апатитов эмали. Продолжающееся образование органических кислот на поверхности эмали приводит к деминерализации и постепенному расширению нанопор в эмали до размеров микропор (диаметром более 100 нм). В результате этого создаются условия для проникновения микроорганизмов в образовавшиеся микропространства, при этом источник кислотообразования переносится внутрь эмали. Таким образом, в нанопорах действуют наномеханизмы разрушения, и когда пространства, возникшие в результате разрушения нанопор, становятся достаточными для проникновения в них микробов, вступает в действие физико-химическая теория.

Рис.1.1.1. Часть здоровой эмали. Поверхностный и приповерхностный слои

Рис.1.1.2. Начало деминерализации. Образуются пространства в эмали, называемые пространственными порами (нанопоры). Поры растут с поверхности в приповерхностную область. Это начальные признаки повреждения эмали и образования области белого пятна. Поверхность эмали становится шероховатой и и теряет блеск

Рис.1.1.3. С продолжением деминерализации число и размер пор увеличивается как на поверхности, так и в объеме эмали и реминерализация не происходит. Пока существует относительно здоровый слой эмали, бактерии не могу проникать внутрь

Рис.1.1.4. С ростом пор, бактерии могут проникать в приповерхностный слой. В этих местах пораженная область уже потеряла потенциал реминерализоваться

Рис.1.1.5. На последнем этапе разрушается значительная часть эмали. Кариес легко обнаруживается визуально. Необходимы стоматологические реставрационные процедуры

2. СЗМ исследования «зубного налета»

Объект исследований представлен в виде поперечных и продольных шлифов зубов, погруженных в емкость с формалином. При извлечении шлифа из консерванта на нем присутствует тонкий неравномерный слой формалина вследствие смачиваемости зуба раствором. Наличие слоя жидкости на поверхности образца отрицательно сказывается на возможности проведения эксперимента, т.к. в колебательный процесс кантилевера (контактного измерительного элемента) вмешиваются непредсказуемые приповерхностные силы, в результате чего в измеряемый сигнал вносятся шумы и большие искажения. На поверхности шлифа могут также присутствовать частички пыли, которые также отрицательно влияют на результаты исследований. Таким образом, достоверную информацию о структуре поверхности получить невозможно.

Для удаления пленки жидкости шлиф зуба на некоторое время помещается на салфетку. В атмосферной среде при комнатной температуре формалин испаряется.

Для получения сканов поверхности образцов используется атомно-силовой микроскоп Solver P47H-PRO, производитель NT-MDT. Выбран сканер с широким пространственным диапазоном сканирования SC150 (50х50х3 мкм). Выбран метод полуконтактной микроскопии (Semi-Contact Microscopy), т.к. при этом взаимодействие зонда с образцом минимально (зонд не может изменять поверхность образца). Выбран кантилевер NSG10 для полуконтактной микроскопии с прямоугольной балкой. Для получения макроснимков шлифов зубов использовался микроскоп Intel.

Перед началом опыта выполняется настройка, позиционирование кантилевера по отношению к лазерному лучу так, чтобы отраженный от кантилевера лазерный луч падал на светоприемник, микроскоп калибруется на специальных калибровочных решетках с периодом 3 мкм.

Далее образец помещается на слой двустороннего скотча, фиксируется в пластилине или воске на время сканирования. Подложка клипсами прижимается к держателю образца.

После установки образца в микроскоп посредством микрометрических винтов выбирается область сканирования. Эта область должна находиться непосредственно под кантилевером.

Далее идет подготовка микроскопа к работе. Выбирается резонансная частота работы кантилевера, выполняется подводка зонда к образцу. Выполняется сканирование.

Эксперименты с образцами c «зубным налетом»

а) Шлиф № СН001–06 при 10х увеличении

б) Шлиф № СН001–06 при 10х увеличении

в) Шлиф № СН001–06 при 60х увеличении

г) Шлиф № СН001–06 при 60х увеличении

д) Шлиф № СН001–06 35х35 мкм

е) Шлиф № СН001–06 35х35 мкм

ж) Шлиф № СН001–06 35х35 мкм

з) Шлиф № СН001–06 2.5 мкм х 2.5 мкм

и) Шлиф № СН001–06 20х20 мкм

к) Шлиф № СН001–06, распределение точек скана по высотам

Уже при увеличении 60х (скан д) видно на поверхности шлифа зуба большое количество царапин, образующих отчетливую макроструктуру. Микроцарапины обнаруживаются и на сканах ж), особенно при анализе сечения поверхности и). Вероятно, царапины остались от инструмента для распиливания зубов. Скан ж) выполнен в области дентина. На нем можно различить зерно размером ~ 1 мкм. Сканы и) и к) выполнены в области, прилегающей к пульпе. Структура стала заметно менее упорядоченной. Зерно на скане к) имеет размер ~200 нм. На скане к) видны углубления, до дна которых зонд «не дотянулся», вероятно, перед нами дентиновые канальцы.

Результаты исследований

а) Шлиф № СН002–06 50х50 мкм, б) Шлиф № СН002–06 12х12 мкм

в) Шлиф № СН002–06 12х12 мкм. После применения фильтра Laplacian 5×5

г) Шлиф № СН002–06 6х18 мкм

д) Шлиф № СН002–06 6х18 мкм. После применения фильтра Laplacian 5×5

На сканах а)-д) приведены изображения структуры налета. На левой части скана а) видно, что кантилевер «не дотянуляся» до сканируемой поверхности вследствие ее кривизны. По правой части изображения можно говорить о том, что налет имеет слоистую структуру. Имеется множество регулярно расположеных впадин (пор) ~3–4 мкм, плотность которых составляет ~1 впадина/25 мкм2. Эти впадины с большим увеличением изображены на сканах в), д). Налет имеет зернистую структуру, зерна призматической формы (см. скан в) рядом со впадиной). Также надо заметить, что в порах и рядом с ними наблюдаются более крупные зерна (особенно видно на скане д)). Зерна вытянутой формы, возможно, из-за несимметричной механической нагрузки при формировании налета. Размер зерна колеблется от 150 нм до 1.5 мкм.

Заключение

Анализ полученных сканов показал, что размер структурных элементов зубного налета не меньше 150нм. В среднем это объекты величиной ~0.8–2 мкм, т.е. их размер много больше нанотехнологической границы 100нм. Таким образом, зубной налет не относится к наноструктурированным материалам. Отдельного исследования требуют вопросы, связанные со способом прикрепления «налета» к поверхности эмали, эти образования можно отнести к наноструктурированным образованиям, но их исследование связано с необходимостью специальной подготовки микрошлифов, а именно необходимо выполнить требования к общей форме зубных шлифов. В дальнейших планах проведение исследований свойств пломбировочных материалов, а частности, эффективности наноструктурированных пломбировочных материалов для нанопоорного пломбирования. Дополнительно для исследования микро- и наноструктуры поверхности необходимо проводить ее предварительную обработку: полировку плоскости сканирования с последующим частичным ее протравливанием. Только после такой обработки можно будет говорить о различной ориентации кристаллов, градиенте плотности вещества, наличии различных структур и поверхностей разделов фаз между ними. Исследования выполнялись при поддержке ЗАО «Нанотехнологические системы» (http://www.nano-systems.ru) и при использовании оборудования молодежного центра коллективного пользования «Нанотехнологические системы и наноэлектроника» кафедры Иу4 МГТУ им.Н.Э.Баумана (http://nanotech.iu4.bmstu.ru).

Авторы: Власов А.И., Кульгашов Е.В., Щёголева В.Д., Бояркина Е., МГТУ им. Н.Э. Баумана, г.Москва, Россия, Московский Государственный стоматологический университет

Vlasov A.I, Kulgashov E.V., Schogoleva E.V., Boyarkina Y.

Moscow State Technological University named after N.E. Bauman, Moscow, Russia

E-mails: vlasov@iu4.bmstu.ru

Список использованной литературы

1. Терапевтическая стоматология: /Е. В. Боровский, Ю. Ю. Барышева, Ю. М. Максимовский и др.; Под ред. Проф. Е. В. Боровского. – 2-е изд., испр. и доп. – М.: /ООО/ Медицинское Информационное Агентство: /ТОО. Техлит, 1997. – 544 с. ISBN 5–89481–0003–5, ISBN 5–900990–02–8.
2. Профилактика стоматологических заболеваний – учебное пособие. Авторы: профессор Кузьмина Э. М., доценты Васина С. А., Петрина Е. С., Смирнова Т. А., ассистенты Гудкова Н. Л., Дорошина В. Ю., Зимина В. И. и др. Москва, Министерство здравоохранения Российской Федерации, Московский медицинский стоматологический институт, кафедра профилактики стоматологических заболеваний, 1997.
3. http://www.uic.edu/…whitspt2.htm