Елена Владимировна Киселева, ведущий научный сотрудник лаборатории морфологии и функции клеточных структур Института Цитологии и Генетики СО РАН, рассказывает об изучении ядерных пор.

Елена Киселева в своей лаборатории
в Институте цитологии и генетики СО РАН

Исследования механизмов транспорта молекул между ядром и цитоплазмой через ядерные поры ведут во многих лабораториях мира. В основном ученые экспериментируют с почкующимися дрожжами Saccharomyces cerevisiae, так как они легко размножаются, что обеспечивает быстрое получение мутантов с нарушением синтеза белков, участвующих в регуляции транспорта. Зная синтез какого белка нарушен, по регистрируемым изменениям экспорта или импорта молекул в ядро можно сделать заключение о функциональной роли данного белка. Помимо этого важно посмотреть, меняется ли тонкое строение ядерных пор, поскольку транспортные факторы взаимодействуют с белками пор – нуклеопоринами. Диаметр ядерных пор у дрожжей составляет всего 95 нм, поэтому увидеть их можно только с помощью электронного микроскопа. Просвечивающий электронный микроскоп дает возможность получить двумерное изображение внутриклеточных структур на срезе целой клетки, а сканирующий – их трехмерное изображение. Правда, для этого клеточные органеллы необходимо осторожно выделить из клетки и быстро зафиксировать, сохранив их прижизненную организацию. Например, объемные снимки ядерных пор дрожжей мы смогли сфотографировать, когда научились изолировать ядра из клеток.

Поскольку просвечивающий микроскоп не обеспечивает достаточного разрешения индивидуальных компонентов ядерных пор, не исключены ошибочные заключения. Так, в конце 1990-х американские ученые, изучив морфологию нескольких тысяч ядерных пор дрожжей в просвечивающем микроскопе, пришли к выводу, что они существенно отличаются по строению от ядерных пор высших эукариот[1].

В этот период я изучала организацию поровых комплексов в составе ядерных оболочек, выделенных из разных объектов, пытаясь выяснить, насколько универсально строение пор. Получив грант от английского фонда Wellcome Trust, я решила повторить исследования американских коллег с использованием высокоразрешающего сканирующего электронного микроскопа – СЭМ. В России такого прибора не было[2], и я поехала в Англию, в Институт Раковых исследований им. Паттерсона (г. Манчестер), где такой прибор имелся. Известные на тот момент методы по изоляции ядер из клеток не сохраняли тонкую морфологию ядерных пор, поэтому пришлось разрабатывать новый метод, что заняло полгода. Когда же метод заработал, полученные в СЭМ снимки показали, что ядерные поры дрожжей не отличаются по строению от пор высших эукариот (например, лягушек). То есть ранее сделанные выводы были неверны, и наши исследования впервые продемонстрировали эволюционную консервативность структурной организации ядерных пор. Эти результаты были опубликованы в 2004 году[3]. Другими авторами было показано, что в организации ядерных пор высших и низших организмов участвует около 30 белков – нуклеопоринов. Вернувшись в Россию, я вместе с моими учениками продолжила исследования ядерных пор, их динамику и механизмы сборки, получая спонсорскую поддержку от фонда Wellcome Trust вплоть до 2007 года. Это дало возможность приезжать на несколько месяцев в Манчестер и использовать имеющийся там замечательный микроскоп. Вместе с английскими коллегами мы опубликовали более 10 работ в ведущих научных журналах, на обложках которых часто демонстрировались полученные мною фотографии.

Исследования ядерных пор и входящих в их состав белков в последние годы оказались тесно связаны с изучением рака[4]. Нарушение синтеза четырех нуклеопоринов (Nup88, Tpr, Nup98, Nup214) было зарегистрировано при различных раковых заболеваниях человека таких, например, как лейкемия, рак груди, желудка, печени, поджелудочной железы и кишечника. Механизм такой корреляции пока не изучен. Предложено несколько гипотез предполагающих полифункциональность перечисленных нуклеопоринов, так как их гиперэкспрессия и взаимодействие с другими белками увеличивает частоту хромосомных перестроек, изменяет интенсивность транскрипции некоторых важных генов, а также нарушает функцию ряда рецепторных белков и даже трансляцию. Кроме того, ингибируется ядерно-цитоплазматический транспорт, что, вероятно, связано с нарушением последовательных этапов сборки ядерных пор. Пока не известно, что конкретно происходит на уровне ядерных пор, и на каком этапе появление клеток с дефектными порами может влиять на развитие рака. Исследование всех этих вопросов невозможно без изучения ультраструктурной динамики ядерных пор высших и, особенно, низших эукариот, таких как дрожжи. Поэтому разработанный нами метод выделения ядер из дрожжевых клеток, позволивший исследовать тонкое строение индивидуальных компонентов ядерных пор, открывает новые возможности в изучении механизмов канцерогенеза.

Это фотография выделенного из дрожжевой клетки ядра. Ядерная оболочка представляет собой сложный комплекс, состоящий из двух различных по составу мембран, ядерных пор и ламины. Ядерные поры (окрашены желтым) – это транспортные каналы, по которым большинство молекул входит и выходит из ядра, согласно имеющимся у них «паспортам» – специфическим последовательностям, узнаваемым белками – переносчиками молекул. Можно сказать, что каждая ядерная пора представляет собой «нанотаможню» для белков и РНК. Автор фотографии Елена Владимировна Киселева, ведущий научный сотрудник лаборатории морфологии и функции клеточных структур Института Цитологии и Генетики СО РАН

[1] Yang Q, Rout MP, Akey CW. Three-dimensional architecture of the isolated yeast nuclear pore complex: functional and evolutionary implications. Mol Cell. 1998, 1(2):223–34

[2] Первый подобный СЭМ в России куплен Московским институтом биомедицинской химии в 2009 году

[3] Kiseleva et al.Yeast nuclear pore complexes have a cytoplasmic ring and internal filaments. J Struct Biol. 2004 Mar;145(3):272–88

[4] Xu and Powers, Semin Cell Dev Biol. 2009. 20(5):620–30

Елена Киселева

Статья опубликована в № 7–8 2009 журнала Российские нанотехнологии