Некоторое время назад ученые из университета Йешивы в Израиле сообщили о том, что смогли проследить за перемещением отдельных молекул внутри клетки. Это было в сентябре 2010 года, и тогда же группа немецких исследователей из института нелинейной оптики и короткоимпульсной спектроскопии смогла запечатлеть превращения молекул в ходе химических реакций. Еще годом ранее, в начале осени 2009 в Харьковском физико-технологическом институте получили изображения и вовсе отдельного атома. Как это делается?

Для изучения процессов, протекающих на уровне молекул и атомов, ученые применяют несколько разных методов, каждый из которых используется для решения своих задач. Там, где требуется изучать живые клетки, нужна мультифотонная микроскопия и специальные методы, позволяющие преодолеть вносимые волновой природой света ограничения на четкость картинки. Где речь идет о процессах, протекающих за ничтожные доли секунды, приходится прибегать к сверхкоротким лазерным импульсам, сжатым до ширины в считанные доли микрометра. Для деталей атомов и молекул применяют разные варианты электронной микроскопии или анализ рассеяния рентгеновских лучей – ну а перемещения белков вдоль друг друга буквально выявляют на ощупь, иглой атомного силового микроскопа.

Cтарая оптика на новый лад

Сегодняшние оптические микроскопы далеко ушли не только от приборов Левенгука, но и от тех устройств, которые можно было застать еще лет двадцать назад. Современный микроскоп часто является сложнейшим комплексом приборов, чья суммарная стоимость превышает среднюю стоимость квартиры в столице: помимо объективов и окуляров в нем можно обнаружить и лазер, и камеры с охлаждаемой матрицей, и высокоточную систему перемещения образца в нужном направлении.

Рис. 1. Современный микроскоп и его основные части.

Автоматическая система сканирования прогоняет под объективом весь исследуемый образец для собирания из серии снимков одной большой картинки. Набор фильтров для наблюдения в разных участках видимого спектра позволяет при использовании флуоресцентных красителей получать многоцветные изображения, попутно определяя местонахождение в исследуемом объекте тех или иных веществ. Конфокальная система способна сканировать объем слой за слоем, строя трехмерную модель образца; ну а приставки для оптической томографии могут выдать трехмерную модель сравнительно крупного предмета: например, мозга мыши или кусочка полученной при биопсии ткани.

Флуоресцентные метки, нашедшие активное применение в «крупномасштабной» микроскопии, упомянуты в контексте гонки за нанометрами не случайно. Молекулу саму по себе, в окружении других молекул, да еще и в живой клетке, ни один микроскоп не сфотографирует – а вот флуоресцентный маркер представляет собой компактное и вдобавок в буквальном смысле слова яркое образование.

Его координаты можно установить с высокой точностью. Группа из университета Йешивы сняла изображение помеченной флуоресцентной меткой молекулы РНК, одновременно через другой фильтр сфотографировала поры в ядерной мембране и применила к полученным данным алгоритмы сверхразрешения: реконструирующие по серии расплывчатых изображений одно, более четкое. Алгоритмы сверхразрешения при удачном сочетании условий позволяют обойти дифракционные ограничения, и оптические микроскопы с их помощью входят в ранее недоступную сферу.

Для справки: Явление флуоресценции – это вовсе не свечение предметов в темноте, которое называют люминисценцией. При флуоресценции молекулы сначала поглощают квант излучения, переходят в возбужденное состояние и излучают часть принятой энергии обратно в виде кванта с большей длиной волны. Яркое свечение предметов при облучении ультрафиолетом связано именно с этим эффектом. При наблюдении через флуоресцентный микроскоп образец освещают, к примеру, синим светом – а фотографируют в зеленом через фильтр, не пропускающий синие лучи. Подбирая разные фильтры и красители, можно получать разные пары: но в однофотонной микроскопии всегда длина волны возбуждающего излучения будет меньше. В мультифотонной микроскопии фундаментальный принцип разделения возбуждающего и испускаемого света при помощи фильтров сохраняется, но перевод молекул красителя в возбужденное состояние осуществляется одновременным поглощением двух фотонов. В этом случае энергия испускаемых квантов будет не меньше, а больше энергии одного из поглощенных фотонов.

То что попутно исследуемый препарат метится молекулами, которые испускают один квант света после поглощения двух, тоже неслучайно. Живая клетка – объект чрезвычайно деликатный и нагрева ярким светом не терпящий: если обычные осветительные системы ее не убьют, то нормальную работу нарушат точно. Бифотонная же микроскопия хотя и требует в миллионы раз большей интенсивности света, вредит образцу меньше: в этом никакого парадокса нет, так как для возбуждения используется не непрерывный луч, а короткие импульсы, которые позволяют еще и точнее локализовать координаты наблюдаемого объекта по вертикали.

Каким образом? Используя то обстоятельство, что для двух- и тем более трехфотонного поглощения нужна высокая плотность энергии. Сфокусировав импульс в небольшой области, можно добиться того, что только в ней молекулы флуорофора будут светится – ни выше, ни ниже при наблюдении через светофильтр ничего видно не будет. Смещая положение светового пятна, образец можно сканировать по вертикали и получать стопку плоских срезов, которые остается только сложить в трехмерное изображение.

Когда на ощупь лучше, чем с виду

Несмотря на все ухищрения с мультифотонной микроскопией, специальные алгоритмы реконструкции изображений и чувствительные камеры, исследовать отдельные молекулы как таковые оптика уже не позволяет. Можно провести простую аналогию: радиопеленгаторы могут определить координаты подвижной радиостанции, но бессильны выяснить ее внутреннее устройство, для определения формы и структуры молекул неизбежно приходится переходить к иным методам.

И здесь уместно обратится к недавно опубликованной журналом Nature работе японских физиков из университетов Каназавы и Гунмы. В ней подробно описывается перемещение отдельных молекул миозина вдоль других белковых молекул, актина. Актин-миозиновый комплекс является ключевой деталью мышечных клеток, сдвиг миозина относительно актина обеспечивает сокращение всего мышечного волокна – ученые смогли «сфотографировать» сокращение мышц на молекулярном уровне.

Слово «сфотографировали» неспроста в кавычках. На прилагаемом к работе видео видно, как молекула миозина движется по актину, причем отчетливо видна форма V-образного миозина, длина которого составляет около 20 нм, что примерно соответствует погрешности определения координат меченой РНК в эксперименте израильской группы. Такое изображение никак не может быть фотографией; более того, оно не может быть и изображением с электронного микроскопа.

Почему? Электронная микроскопия, в которой лучи света заменены на пучки электронов, а в роли линз выступают магнитные поля, требует вакуума. С поверхности образца надо откачать воздух, и это не просто неудобно: о возможности посмотреть на живые объекты в динамике можно забыть сразу из-за вакуума, большой энергии электронного пучка и необходимости вдобавок обрабатывать объекты так, чтобы те стали проводить электрический ток.

Рис. 2. Атомный силовой микроскоп.

Несмотря на выдающиеся успехи в других областях, электронная микроскопия ничем не могла бы помочь в случае с клетками. А вот атомная силовая микроскопия, АСМ – это то, что требуется в подобных случаях: она позволяет если не заглянуть внутрь клетки, то хотя бы увидеть биомолекулы на органической подложке «живьем», в максимально похожих на внутриклеточные условия. Точнее даже не увидеть, а ощупать, поскольку ключевой элемент АСМ – микроскопическая игла на свободно висящей над образцом балке, микропружине.

Игла при приближении к поверхности отклоняется силами межмолекулярного взаимодействия, и это позволяет сканировать поверхность в двух режимах – «прилипая» к изучаемому образцу или двигаясь над ним, но наблюдая за колебаниями держащей иглу микропружины. В первом случае поверхность практически в буквальном смысле слова ощупывается, а во втором сканируется с некоторого, порядка нескольких нанометров, расстояния. Точная механика, заостренная до атомных масштабов игла, регистрация движения держащей иглу микропружины (кантиливера – что в переводе с английского и есть «балка») при помощи лазерного луча – совокупность этих методов обеспечивает возможность увидеть даже не молекулы, а атомы в кристалле поваренной соли. Причем без вакуума, достаточно просто устойчивого основания и чистого помещения.

Впрочем, видео с такого прибора все равно еще недавно было практически фантастикой. Сканировать поверхность с частотой, достаточной для получения картинки мало-мальски приличного качества в реальном времени получилось лишь на рубеже XX и XXI веков, соответственно, для исследователей это сравнительно новый инструмент.

Портреты атомов и молекул

АСМ может дать изображение поверхности материала с отдельными атомами, а оставшийся за рамками обсуждения сканирующий туннельный микроскоп позволяет даже произвольно переставлять их на манер детских кубиков (сотрудники IBM так сложили в начале 90-х логотип компании). Но как быть, если мы хотим заглянуть еще дальше и посмотреть, к примеру, на электронные облака?

Для справки: Сканирующий туннельный микроскоп, при помощи которого можно не только разглядывать, но и перемещать атомы, во многом схож с АСМ. В нем так же имеется сверхострая игла, которая перемещается вдоль поверхности – но отличие схемы туннельного микроскопа состоит в том, что между иглой и образцом поддерживается разность потенциалов. Разность потенциалов приводит к возникновению тока, причем не просто пробоя, а тока, текущего за счет квантовомеханического туннельного эффекта, электроны «проскакивают» через изолирующий промежуток вопреки классической электродинамике, отсюда и название. Чем больше промежуток, тем слабее ток – и поддерживая перемещением иглы постоянную силу тока, можно просканировать поверхность. Иглой также можно зацепить и переместить отдельные атомы, что открывает возможность сборки сверхмалых структур в буквально поатомном порядке. Кстати, в 2005 году в качестве иглы туннельного микроскопа использовали углеродные нанотрубки.

На первый взгляд это уже невозможно. И, действительно, законы квантовой механики говорят что электронное облако при взаимодействии даст вовсе не объемную картинку из учебника химии, а точку. Если этих точек набрать достаточно много, то может действительно получится облако – но как это сделать? Группа ученых из Харьковского физико-технического института использовала разновидность электронной микроскопии, при которой в электрическом поле подвешивалась тонкая, всего в один атом толщиной, углеродная нить. Испускаемые ею электроны падали на флуоресцирующий экран и давали каждый всего одну вспышку – но сочетание многих электронов рисовало уже полноценную картинку.

Картинку, на которой удавалось разглядеть как s-орбитали в виде шара, так и p-орбитали в виде объемных восьмерок. И хотя принципиально ничего нового здесь увидеть не удалось, ученые отмечают что их метод можно адаптировать для молекул с менее очевидной структурой.

По материалам: