Коллектив учёных из Бельгии и Германии предлагает интересный метод прижизненного наблюдения за толщиной клеточной стенки микроорганизмов.

Обычно детали строения клеточной стенки изучают при помощи электронной микроскопии. Для этого препарат микроорганизмов фиксируют и нарезают на ультратонкие срезы – разумеется, клетки при этом умирают, и нет никакой возможности проводить прижизненные наблюдения.

Зачастую бывает интересно посмотреть, как именно меняется толщина клеточной стенки в ответ на изменение условий окружающей среды, проследить за динамикой этого процесса в живых клетках. И вот учёные придумали для этих целей «молекулярную линейку».

Рис. 1. Принцип действия «молекулярной линейки»: если модифицированный трансмембранный белок с полигистидиновым тэгом на внешнем конце способен взаимодействовать с АСМ-зондом, имеющим функциональную Ni-NTA группу, – значит, толщина клеточной стенки меньше, чем длина «линейки».

Суть метода отображена на рис. 1 и состоит в следующем. Представьте себе, что в клетке имеется белок, свёрнутый в глобулу определённой длины. Известная часть этого белка расположена в цитоплазме, другая часть проходит сквозь клеточную мембрану, и, наконец, третья часть торчит из мембраны наружу – а вернее, внутрь клеточной стенки. Пусть длина третьей части нам известна – это и есть «молекулярная линейка». Допустим, на внешнем конце у нее имеется какая-нибудь функциональная группа – например, гистидиновый тэг. Тогда, если длина «линейки» больше, чем толщина клеточной стенки, с этой гистидиновой группой может взаимодействовать зонд атомно-силового микроскопа, кончик которого модифицирован группой Ni-NTA (см. рис. 2).

Рис. 2. Взаимодействие гистидиновых остатков с Ni-NTA. Желтым цветом обоначен АСМ-зонд, лиловым – Ni-NTA, черным – гистидины, синим – белок.

Придумав принцип, учёные отработали его на экспериментальных клетках – дрожжах. Конечно, подходящего белка в дрожжах не нашлось, пришлось прибегнуть к методам генной инженерии. За основу взяли некий белок Wsc1, у которого имеются требуемые цитоплазматическая и трансмембранная части, а вот третья часть слишком коротка – заканчивается где-то в толще клеточной стенки. К этой части были добавлены дополнительные аминокислоты, чтобы получить «линейки» разной расчётной длины – 90 нм, 107 нм, 117 нм и т.д. На концах «линеек», как вы уже догадались, расположилась последовательность из восьми гистидиновых остатков.

Рис. 3. «Сенсограммы», позволяющие определить толщину клеточной стенки. Синие точки относятся к обыкновенным пекарским дрожжам, красные – к мутантным клеткам с утолщённой клеточной стенкой.

При помощи метода «молекулярных линеек» учёные определили, что толщина клеточной стенки обыкновенных пекарских дрожжей составляет 115 нм, а дрожжей-мутантов с утолщённой клеточной стенкой – 140 нм (рисунок 3). Обрабатывая клетки веществами, которые должны приводить к увеличению или уменьшению толщины клеточной стенки, учёные, действительно, получали соответствующие отклики от своих «линеек».

Интересно, что по данным просвечивающей электронной микроскопии толщина клеточной стенки обыкновенных пекарских дрожжей оценивается в 105 нм. Казалось бы, новый метод даёт довольно близкое значение (115 нм). Однако авторы исследования считают, что разница почти в 10% является существенным расхождением, и предлагают несколько объяснений этому. Во-первых, длину «молекулярных линеек» не измеряли, а рассчитывали исходя из знаний о размерах аминокислот и длине пептидных связей. Но учёные утверждают, что не могли ошибиться в своих расчетах на целых 10 нм. Поэтому они более склонны полагать, что это ПЭМ даёт заниженные значения из-за артефактов, возникающих в процессе приготовления препарата, а предложенный ими метод более точен.

Результаты исследований представлены в статье:

Vincent Dupres, Yves F. Dufrne and Jrgen J. Heinisch Measuring Cell Wall Thickness in Living Yeast Cells Using Single Molecular Rulers. – ACS Nano, Article ASAP DOI: 10.1021/nn101598v Publication Date (Web): August 30, 2010.

По материалам: