Прогрессом в нашем понимании основных биологических процессов и болезней человека мы во многом обязаны новаторским исследованиям ученых Лаборатории хромосомной динамики (Chromosome Dynamics Laboratory) Института передовой науки RIKEN (RIKEN Advanced Science Institute) в Йокогаме, Япония.

Во многих отношениях кодирующая наш геном ДНК – замечательная молекула. Если вытянуть ее в тонкую нить, длина этой нити составит 1,8 метра. При этом в каждой клетке, размером менее десятой доли миллиметра, ДНК должна реплицироваться и точно разделяться так, чтобы при делении могли образоваться две полноценные дочерние клетки. Ключом к этому процессу является хромосома. Общепринятым научным мнением было то, что для конденсации реплицированной ДНК при образовании хромосомы необходим неизвестный белок, или, возможно, несколько белков. Однако долгожданная белковая машина, конденсирующая хромосомы, была открыта только в 1997 году Татсуйя Хирано (Tatsuya Hirano), ныне научным руководителем Лаборатории хромосомной динамики RIKEN. Открытие Хирано белкового комплекса конденсина признано крупным прорывом, который привел к быстрому прогрессу не только в расшифровке базовых биологических процессов с участием хромосом, но и в понимании болезней человека, обусловленных хромосомными аберрациями.

Черный ящик хромосомы

«В начале 80-х годов, когда я поступил в университет, на первой странице моего учебника биологии я увидел молекулярную структуру двойной спирали ДНК», – рассказывает Хирано. «Учебник описывал и тогда только что сделанное открытие о том, что ДНК накручена на гистоны, образуя структуру, называемую хроматином».

В то время было известно и то, что хроматин тоже должен быть сконденсирован, чтобы образовать хромосому (Рис.1) – структуру, которую наблюдали в оптический микроскоп еще в XIX веке. Тем не менее, существовал большой разрыв в нашем понимании хроматина и хромосом. И белки, участвующие в конденсации хроматина, и механизм их действия оставались черным ящиком.

«Мне хотелось открыть этот ящик, и именно поэтому я заинтересовался хромосомой».

Хирано поступил в аспирантуру Киотского университета (Kyoto University) и начал работу в лаборатории Мицухиро Янагиды (Mitsuhiro Yanagida), где он занимался исследованием хромосом дрожжей генетическими методами.

«Моим первым проектом было создание множества мутантов делящихся дрожжей. В поисках мутантов, демонстрирующих различные аномальные формы хромосом, мне удалось обнаружить многие гены, вовлеченные в морфогенез хромосом и их сегрегацию. Однако я не был полностью удовлетворен генетическим подходом и стал интересоваться более прямыми методами анализа хромосом, а именно, биохимией. Но я быстро узнал, что обычные биохимические методы не позволяют нам выделить хромосомы из клетки в очень чистом виде».

Открытие конденсина

В 1989 году Хирано начал работу в лабораторию Тима Митчисона (Tim Mitchison) в Университете Калифорнии – Сан-Франциско (University of California in San Francisco), США, где разрабатывалась экспериментальная система сборки хромосом in vitro.

«Для получения экстракта с высокой концентрацией белка раздавливались яйца лягушки. Удивительно, но, поместив в этот экстракт ДНК, можно было получить хромосомы. Так как полученные в такой in vitro системе хромосомы можно довольно легко извлечь в чистом виде, анализ их белковых компонентов стал намного проще», – объясняет Хирано.

Использовав преимущества этой экспериментальной системы, в 1994 году Хирано открыл два новых белка, необходимых для конденсации хромосом – SMC2 и SMC4.

«Чтобы подтвердить, что некоторые связанные с SMC гены каким-то образом вовлечены в функции хромосом, как раз в это время были начаты исследования, в которых использовались почкующиеся дрожжи и нематоды. Однажды мой научный руководитель позвонил мне и сообщил, что он тоже нашел два связанных с SMC гена, анализируя мутантов делящихся дрожжей с морфологически аномальными хромосомами. Еще более удивительно, что один из мутантов был идентичен одному из открытых мной в бытность мою аспирантом».

Таким образом, биохимический анализ хромосомных белков лягушки, проведенный Хирано, был поддержан генетическим анализом дрожжей и нематод, подведя его к очень общему заключению о том, что SMC-белки играют центральную роль в динамике хромосом. Однако эта работа была лишь прелюдией к гораздо более масштабному исследованию.

В 1995 году Хирано уехал в Cold Spring Harbor Laboratory на восточном побережье США и создал собственную лабораторию. В 1997 году он открыл, что SMC2 и SMC4 образуют комплекс с тремя другими белками и что этот комплекс, названный им конденсином, играет важнейшую роль в конденсации хромосом.

«Проанализировав комплекс конденсина под электронным микроскопом, мы установили, что он имеет форму маленького зажима. До того времени никто никогда не видел белкового комплекса такой странной формы. Однако, если подумать, эта форма идеально подходит для укладки длинной нити хроматина в компактную хромосому».

Когезиновый клей

Середина 90-х годов отмечена рассветом исследований генома. В 1996 году был полностью расшифрован геном почкующихся дрожжей, и стало ясно, что в их геноме существует четыре типа белков SMC.

«Чтобы изучить роль других двух типов, SMC1 и SMC3, мы провели серию экспериментов с использованием экстракта яиц лягушки. Мы установили, что эти два типа SMC также образуют большой комплекс с другими белками, но в процессе деления клетки этот комплекс работает совершенно по-другому, чем конденсин».

В период с 1997 по 1998 год успешными работами нескольких исследовательских групп было продемонстрировано, что этот комплекс функционирует в качестве «клея», связывающего две сестринские хроматиды. Теперь он известен как когезин (Рис. 1).

Рис. 1. Конденсация ДНК в хроматин и хромосому. (Copyright : RIKEN)

«Классические исследования позволили нам предсказать, что должны существовать белки, ответственные за конденсацию и когезию хромосом. Однако оказалось, что белки, ответственные за эти два процесса, конденсин и когезин, содержат в своем основном компоненте SMC, обладая, таким образом, структурным сходством друг с другом. Это было совершенно неожиданно».

Возникновение и эволюция жизни с точки зрения конденсина

«Еще более удивительно, что конденсин-подобные белки были обнаружены у прокариотических организмов, включая Escherichia coli и другие бактерии, эволюционировавших раньше, чем эукариоты», – продолжает Хирано. Репликация и сегрегация генетической информации имеют фундаментальное значение для жизни, и в то время как механизмы клеточного деления прокариот (не имеющих ядра) и эукариот, несомненно, различны, «белки, ответственные за конденсацию хромосом, являются общими».

Самовоспроизведение рассматривается как одно из фундаментальных свойств, определяющих понятие «жизнь».

«Когда самые первые организмы, способные к репликации ДНК, появились на Земле, они столкнулись с серьезной проблемой – как организовать репликацию цепочек ДНК и разделить их по двум дочерним клеткам. Предковый белок, из которого образовался конденсин, возможно, появился для решения этой проблемы вскоре после возникновения жизни».

Однако у прокариот не было найдено белка, соответствующего когезину.

«Прокариотический конденсин служит как для конденсации, так и для когезии, и когезин, по-видимому, возник из древнего конденсина в процессе эволюции, возможно, при зарождении эукариот».

Другим значительным открытием было то, что высшие животные и растения обладают вторым типом конденсина.

«В 2003 году мы открыли этот новый тип конденсина в клетках человека. Исходный тип теперь называется конденсином I, а второй тип – конденсином II. Интересно, что конденсины I и II расположены поочередно вдоль оси хромосомы. Если из клетки экспериментально удалить конденсин I или II, аномальная морфология хромосом проявляется по-разному, доказывая, что функции этих двух комплексов не пересекаются».

Организмы с относительно небольшими геномами, такие как дрожжи, имеют только конденсин I, в то время как у многих высших животных и растений с большими геномами обнаружены как конденсин I, так и конденсин II (Рис. 2). С точки зрения эволюции конденсин II, вероятно, возник совсем недавно. У высших животных и растений хромосомы имеют удлиненную форму, что привело к необходимости кооперации конденсинов I и II для их конденсации.

Рис. 2. Конденсин I и II в хромосоме человека. Конденсин I (зеленый) и II (красный) расположены поочередно вдоль оси хромосомы (синяя). Фракция конденсина I концентрируется в непосредственной близости от центромеры (две красные продолговатые области). Хотя SMC2 и SMC4 являются общими для конденсина I и II, они отличаются тремя другими белками. (Copyright : RIKEN)

Открывая черный ящик

Хирано открыл первый ключ от черного ящика конденсации хромосом.

«В 1997 году мне удалось открыть конденсин и продемонстрировать, что он является посредником конденсации хромосом. Но это было только начало долгого пути. Даже теперь точный механизм конденсации еще не полностью выяснен. Хотя предложена модель, в которой несколько белков конденсина, связывающих петли ДНК, собираются в плотно расположенные скопления, мы еще не знаем, действительно ли верна такая модель».

Вернувшись в 2006 году в Японию, Хирано основал Лабораторию хромосомной динамики в Институте передовой науки RIKEN.

«В моей лаборатории работают специалисты, представляющие широкий спектр исследовательских областей, включая кристаллографию белков, биохимию и клеточную биологию. Я хочу выяснить механизм конденсации хромосом, эффективно используя все доступные методы. Это дело всей моей жизни».

Среди многих подходов, применяемых учеными в его лаборатории, экстракт яиц лягушки остается самой мощной экспериментальной системой.

«Используя эту систему, мы может анализировать процессы конденсации и сегрегации хромосом на беспрецедентном уровне».

Исследованиями последних десяти лет твердо установлено, что, поддерживая процессы конденсации и сегрегации, конденсин и когезин работают вместе (Рис.3). После репликации ДНК когезин связывает реплицированные пары ДНК (сестринские хроматиды). Когда клетка готовится к делению, почти весь когезин отделяется, за исключением небольшого количества вблизи центра хромосомы (центромеры), в то время как конденсин конденсирует сестринские хроматиды. Наконец, отделяется остаточный пул когезина, и сестринские хроматиды разделяются и расходятся по двум дочерним клеткам.

Рис. 3. Процесс конденсации и сегрегации хромосом (внизу) при клеточном делении (вверху). После репликации ДНК когезин функционирует в качестве клея для связывания двух ДНК-последовательностей ((1) и (2)). Затем когезин отделяется (за исключением области центромеры), и конденсин начинает конденсировать сестринские хроматиды (3). Наконец отделяется и остальной когезин, а сестринские хроматиды равномерно распределяются по дочерним клеткам (4). Фаза 3 соответствует последовательности, показанной на рис. 1. (Copyright : RIKEN)

«Манипулируя уровнем белков, регулирующих функцию когезина в экстракте яиц лягушки, или добавляя мутантную форму регуляторных белков с различной функциональностью, действие конденсина и когезина можно изменять по желанию», – говорит Хирано (Рис. 4). С помощью этого типа экспериментов мы пытаемся выяснить механизм взаимодействия конденсина и когезина в процессе конденсации и сегрегации хромосом».

Рис. 4. Функция когезина. Слева: хромосома с усиленной функцией когезина. Разделение сестринских хроматид недостаточно. В середине: нормальная хромосома. Сестринские хроматиды расположены параллельно по всей длине ДНК. Справа: хромосома с ослабленной функцией когезина. Сестринские хроматиды расходятся слишком далеко друг от друга. (Copyright : RIKEN)

Хромосомно-опосредованные заболевания и биологические феномены

За последние годы сообщалось о нескольких примерах заболеваний человека, связанных с нарушением регуляции конденсина или когезина.

«Микроцефалия – заболевание, для которого характерно выраженное уменьшение размеров лобной доли головного мозга. Немецкая исследовательская группа изучила клетки пациентов с этой болезнью и обнаружила значительные изменения в конденсации хромосом. Мы начали сотрудничество с этой группой и установили, что в клетках таких пациентов аномально активирован конденсин II», – говорит Хирано.

При нарушении функции конденсина и дефекте конденсации во время развития мозга может нарушаться работа одного из важнейших генов формирования мозга, что, в свою очередь, может стать причиной микроцефалию.

Татсуйя Хирано (Tatsuya Hirano), Ph.D. (asi.riken.jp)

«Таким образом, вполне возможно, что конденсин принимает участие в регуляции экспрессии генов. Правильное формирование и функционирование организма может быть достигнуто, только если нужные гены работают в соответствующих клетках, когда это необходимо. Недавнее открытие того, что метилирование ДНК или гистонов оказывает влияние на состояние экспрессии генов, стало стимулом для целого каскада исследований во многих областях наук о жизни. Такие молекулярные фрагменты, как метильные группы, контролируют экспрессию отдельных генов. Конденсин, с другой стороны, возможно, контролирует ее более глобально, управляя конденсацией хромосом».

Изучение конденсина и когезина, как ожидается, будут полезны для понимания этиологии болезней, причиной развития которых являются хромосомные аберрации. Как правило, человек наследует два набора хромосом – один от отца, а другой от матери. Однако у пациентов с синдромом Дауна, например, три копии 21-ой хромосомы, что приводит к ряду патологических состояний.

«Точная причина ненормального наследования хромосом у таких пациентов неизвестна, но ею может являться некорректная работа когезина в 21-ой хромосоме».

Действительно, у мышей с дефицитом когезина наблюдается увеличение частоты хромосомных аберраций по материнской линии. Поэтому модель синдрома Дауна, воспроизведенная на мышах, может способствовать уточнению этиологии этого заболевания и разработке методов его лечения.

«Наша группа работает и над мейозом, используя в качестве модельного организма мышей. Известно, что вероятность того, что хромосомы неправильно распределятся при мейозе, у людей в десять раз выше, чем у мышей, и что это является одной из основных причин бесплодия. Хотя причина до сих пор неизвестна, исследования конденсина и когезина могут привести к решению этой загадки».

Открытие Хирано конденсина и когезина значительно продвинуло вперед изучение хромосом.

«Учитывая фундаментальное значение хромосом для жизни, дальнейшие исследования могут привести к ряду неожиданных открытий в ближайшие годы», – считает ученый.