Маркировка внутриклеточных белков флуоресцирующими метками настолько революционизировала изучение их биологии, что в 2008 году международное научное сообщество отметило создателей этого метода (Осаму Cимомуру, Роджера Тсьеня и Мартина Чалфи) Нобелевской премией. Теперь же ученые Медицинского колледжа Вэйлла Корнелла (Weill Cornell Medical College) разработали флуоресцентный инструмент, способный отслеживать таинственную работу различных форм клеточной РНК.

В июльском номере журнала Science ученые из Weill Cornell сообщили о разработке РНК-аналога зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP) и описали, как с его помощью можно раскрывать секреты молекул РНК – поддерживающих жизнь и вносящих вклад в развитие заболеваний.

Сами Джаффри
(Samie Jaffrey), Ph.D.
(weill.cornell.edu)

«Ученые привыкли считать, что функции РНК ограничены выработкой белков и что только белки управляют всем, что происходит в клетке», – говорит старший автор статьи доктор Сами Джаффри (Samie Jaffrey), адъюнкт-профессор кафедры фармакологии Weill Cornell. «Но теперь мы начинаем понимать, что в клетках много различных форм РНК и что некоторые из них оказывают влияние на клеточный сигналинг и экспрессию генов, никогда не принимая участия в синтезе белков. Флуоресцентные РНК дают нам инструмент, который будет иметь решающее значение для изучения различных ролей РНК в биологии человека».

Список известных типов РНК быстро пополняется  – от матричной РНК, кодирующей белки, до различных некодирующих РНК, влияющих на трансляцию и экспрессию генов, а в некоторых случаях связывающихся с белками и регулирующих их функции – и, тем не менее, о том, как работают эти РНК, известно совсем немного.

Первый автор исследования доктор Джереми Пейдж (Jeremy Paige) считает, что новая технология может прояснить механизмы развития распространенных заболеваний.

«Все больше и больше заболеваний оказываются связанными с неправильной регуляцией РНК, но, не имея возможности видеть саму РНК, нельзя понять, каким образом эти процессы ведут к заболеванию. Мы надеемся, что наши РНК-аналоги GFP откроют путь к их пониманию», – говорит он.

Компьютерная модель вторичной структуры
зеленого флуоресцентного белка (GFP).
Ген, кодирующий этот белок, можно ввести
в геном любого животного,
растения или гриба, и при освещении синим
или ультрафиолетовым светом экспрессирующие
его клетки и ткани будут светиться зеленым.
(Фото: Science Photo Library)

Разработанные группой профессора Джаффри РНК функционируют, как зеленый флуоресцентный белок – природный белок медузы Aequorea Victoria, светящийся зеленым светом. GFP дал ученым возможность наблюдать за тем, как белки перемещаются в клетке, что позволяет понять их функции. Чтобы заставить нужный белок светиться, ДНК, кодирующая GFP, помещается рядом с геном, кодирующим этот белок, что приводит к экспрессии слитого с GFP белка. Такой белок слияния можно наблюдать с помощью специальных микроскопов.

Чтобы создать молекулу РНК, функционирующую как GFP, ученые воспользовались способностью РНК сворачиваться в сложные трехмерные структуры. Им нужно было создать синтетическую последовательность РНК, способную принимать необходимую пространственную конфигурацию, и малую молекулу, которая начинала бы флуоресцировать после взаимодействия с новой РНК.

«Мы должны были решить две гигантские проблемы», – объясняет доктор Джаффри. «Первая – придумать последовательность РНК, которая могла бы «включать» малую молекулу. Вторая – найти малую молекулу, которая флуоресцировала бы только когда это нужно и не была бы токсичной для клеток».

Ученые протестировали множество молекул (традиционных условно флуоресцирующих красителей), но большинство из них начинали флуоресцировать, взаимодействуя с липидами клеточной мембраны, или убивали клетку. Тогда они обратились к структуре GFP: молекула-флуорофор GFP находится внутри самого GFP, и структура белка защищает ее от тушения флуоресценции компонентами микроокружения. Светиться же она начинает только тогда, когда связывается с белком строго определенным образом. Джаффри и Пейдж получили молекулы, основываясь на структуре этого флуорофора, а затем разработали искусственную последовательность РНК, или аптамер, удерживающую свой флуорофор точно так же, как это делает GFP. За ярко зеленую флуоресценцию этот комплекс был назван «Шпинатом».

Существующие сейчас флуоресцентные белки демонстрируют богатую палитру цветов, что позволяет ученым одновременно отслеживать несколько типов белковых молекул. Джаффри и Пейдж решили не останавливаться на достигнутом и в дополнении к Шпинату разработали еще несколько комплексов «РНК-флуорофор», светящихся разными цветами. Так как по традиции производным GFP присваивают названия фруктов, ученые окрестили свои флуоресцирующие комплексы овощными именами – Шпинат, Морковь и Редис.

Аптамеры РНК включают флуоресценцию GFP-подобного флуорофора. (А) Структуры HBI (4-hydroxybenzylidene imidazolinone) (показана зеленым) в контексте GFP и DMHBI (3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzylidene imidazolinone). (В) 13–2 РНК усиливает флуоресценцию DMHBI. Растворы, содержащие DMHBI, 13–2 РНК, DMHBI с 13–2 РНК и DMHBI с РНК клеток линии HeLa (контроль) сфотографированы при освещении волной 365 нм. (Fig.1, 10.1126/science.1207339)

Исследователи уже начали использовать Шпинат для отслеживания некодирующих РНК и смогли наблюдать, как флуоресцирующая зеленым некодирующая РНК быстро кластеризуется в ответ на клеточный стресс.

«Наша лаборатория очень заинтересована в понимании того, почему дефекты в транспорте РНК ведут к нарушениям развития у детей, таким как умственная отсталость», – говорит доктор Джаффри. «Мы считаем, что Шпинат даст новые представления о транспорте РНК в клетках, а также о нарушениях этого процесса при заболеваниях».

«РНК окружают еще много тайн. Флуоресцентная маркировка и визуализация стали мощным инструментом в руках ученых, и мы надеемся, что таким же инструментом, помогающим ускорять научные открытия, станет и Шпинат», – заключает доктор Пейдж.

Аннотация к статье

RNA Mimics of Green Fluorescent Protein