Интервью с Дмитрием Александровичем Долгих, доктором биологических наук, профессором, руководителем лаборатории инженерии белка Отдела биоинженерии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

- Дмитрий Александрович, расскажите, пожалуйста, когда была создана лаборатория, которой Вы руководите?

Лаборатория под руководством академика Михаила Петровича Кирпичникова была создана в 2002-м году в результате слияния двух близких по тематике коллективов Института: лаборатории химии генов – её руководитель Вячеслав Григорьевич Коробко ушел из жизни в январе 2002 года, и группы Кирпичникова, входившей на тот момент в лабораторию спектрального анализа. А около двух лет назад на базе этой лаборатории был организован Отдел биоинженерии во главе с Михаилом Петровичем. А я руковожу лабораторией инженерии белка в этом Отделе.

- Когда российские учёные заинтересовались инженерией белка?

Белковая инженерия началась в 80-х, может быть, в конце 70-х годов, когда появилась возможность целенаправленно изменять белки. До этого белки изучали люди давно, много было сделано, но всё это, пока не было генной инженерии, было на уровне «посмотреть», изучить какие-то характеристики. Была наука о белке: физика белка, химия белка. Но инженерии не было, так как инженерия – обязательно какое-нибудь изменение природных или неприродных объектов для нужд человека, или создание новых объектов. Белковая инженерия появилась тогда, когда генная инженерия смогла манипулировать с генами белков, и, меняя гены, менять и белки, которые с них синтезируются. Инженерия белка – это стопроцентно нанотехнология. Так как есть нанообъект, и мы можем его целенаправленно менять, поэтому можно считать, что нанотехнологиями мы стали заниматься задолго до того, как появилось слово «нано».

- Какими белками занимаются сотрудники Вашей лаборатории?

Мы занимаемся белками, которые имеют научный и практический интерес. В настоящее время в Отделе более десятка объектов, а если учесть различные мутантные (модифицированные) варианты белков, то существенно больше. Один из наиболее интересных классов белков – мембранные белки, их долгое время не изучали, потому что не умели выделять. Если их просто выделить в чистом виде, они нерастворимы, в воде они выпадают в осадок. Бывший директор этого Института академик Юрий Анатольевич Овчинников был одним из первых исследователей, которые взялись за изучение мембранных белков – это был бактериородопсин. На каком-то этапе у нас даже было мировое лидерство в данной области, в частности, была впервые получена аминокислотная последовательность этого белка.

- Почему так важно изучать мембранные белки?

Они сидят на поверхности клетки, а большинство сигналов – проходят через поверхность, и мембранные белки являются рецепторами, которые проводят эти сигналы. Это имеет непосредственное отношение к медицине.

Ещё мы занимаемся такими интересными белками, как нейротоксины. Сначала их извлекали из яда змей. Потом появилась белковая инженерия, люди научились получать рекомбинантные белки, то есть змеи для получения нейротоксинов стали не нужны. Когда мы знаем последовательность гена нейротоксина, то, в принципе, можем получить этот белок в бактериях. Однако белок хотя и маленький, но весьма сложный, содержит много дисульфидных связей. И наша лаборатория была, фактически, первой, которая смогла получить нейротоксин в достаточно больших количествах. Была разработана система экспрессии и сразу появилась возможность изучать, модифицировать, смотреть специфичность – как он взаимодействует со своими рецепторами, изучать другие похожие белки. Интересно, что змеи – змеями, но и у человека есть подобные белки. Когда яд змеи воздействует на человека, он воздействует именно потому, что у человека эта система есть. И в этом направлении у нас есть тоже успехи, мы исследуем белки, которые до нас никому не удавалось изучать. Хоть и рано говорить, что на этой основе будет сделано лекарство, но мы работаем над этим.

- Неужели в человеческом организме тоже вырабатываются нейротоксины?

Нет, их нельзя в полной мере назвать «нейротоксинами», это белки, структурно похожие, которые тоже связываются с «нужными» рецепторами и выполняют определённые функции.

- Они действуют как противоядие?

Их функции даже не очень понятны. Наверное, они могут быть использованы как противоядие. Понимаете, когда мы это исследуем детально, понимаем механизм, можно думать и о противоядии, и об использовании этих компонентов яда – они же чистые, не загрязненные другими токсинами, – в качестве лекарства. Тем более, что мы можем менять их свойства. Была такая научная работа, где выяснилось, что вот этот нейротоксин связывается с одним видом рецепторов, а с другим не связывается. А другой нейротоксин, который очень похож, связывается с обоими видами рецепторов. За счёт чего? Нашли «подозрительные» различия в последовательности, поняли, что именно они отвечают за связывание и пересадили соответствующий участок с одного нейротоксина на другой. И тот прекрасно стал связываться со всеми рецепторами! Выяснение механизмов взаимодействия с рецепторами – это те знания, которые, в конце концов, могут и должны привести нас к практическим результатам.

- Расскажите о практических проектах лаборатории.

Очень важное направление, которое развивается в лаборатории не год и не два, это антитела. Вы знаете, что если мы заболели какой-то инфекцией, которая привела к появлению в нашем организме чужеродного материла – «антигена», то наш организм начинает вырабатывать антитела на этот антиген, например, на вирус или бактерию. При этом организм болеет. Если он не заболеет, то никаких антител и не будет, нужна реакция. Но зачем вообще вырабатывать антитела в человеческом организме, если он при этом мучается, когда можно их выработать в организме животного или даже in vitro? Изначально делали антитела мышиные или других животных. Кстати, сыворотка против змеиного яда – это лошадиные антитела. Если вас укусила змея, то вы не успеете выработать свои антитела, яд может вас убить быстрее. Но если есть готовые лошадиные, их нужно как можно скорее вколоть, и компоненты яда будут схвачены ими и выведены из организма. Чужеродные антитела – лошадиные, мышиные – довольно токсичны, они вызывают иммунный ответ человеческого организма. Как известно, антитела имеют «Y»-образную форму. На конце этой «вилки» – участки, непосредственно связывающие антиген, но средняя часть – Fc фрагмент – тоже важна, она запускает систему комплимента. Антитело связалось с антигеном, заработала система комплимента – в результате чужеродный элемент уничтожен.

- Каким образом информация передаётся от белка к белку?

Антитело не передаёт само информацию. Оно просто связывается с антигеном и немного изменяется при этом. А рядом находятся компоненты, которые распознают эти антитела и могут «понять», что они уже связались. Роль информаторов тоже выполняют белки. Они садятся на связанные антитела, меняется конформация, приходят какие-то другие белки. У мышиных антител части, связывающиеся с антигеном, мышиные, и средняя часть – Fc -фрагмент – тоже мышиная. Она систему комплимента в человеческом организме не запускает. Мы подумали: а если заменить мышиный Fc – фрагмент на человеческий? Получается так называемое химерное антитело. Посмотрели – оно работает лучше. На следующем этапе из мышиных антител оставляют только распознающие участки. Там всего с десяток аминокислот. А все остальные делают человеческими – это уже «гуманизированные» антитела. Чем больше в антителах человеческого, тем лучше. Идеальный вариант – это когда всё человеческое. Но нарабатывать антитела в человеке сложно. Правда, сейчас выведены специальные мыши – XenoMouse, которые имеют иммунную систему человека. И эти мыши вырабатывают, фактически, человеческие антитела. Это всё патентованное, очень дорого стоит. Для научных целей мы ещё можем их использовать, но в промышленных масштабах – никак. Да это, впрочем, и не очень нужно. Потому что гуманизированные антитела уже весьма хороши. Мышиное – это действительно чужеродное, оно вызывает иммунный ответ. А на гуманизированные антитела такого ответа почти нет. Совсем на человеческие тем более не должно быть (хотя мы знаем, что даже на свои собственные белки бывает иммунный ответ и это приводит к аутоиммунным заболеваниям).

Если говорить о белках как лекарственных средствах – это 21-й век, это «номер один», потому что много есть лекарств, но белковых уже сейчас продают на 100 миллиардов долларов в год. И антитела в этих миллиардах составляют 80 или 90 процентов.

- Белковые лекарства лучше химических препаратов небелковой природы?

Конечно, ведь это «своё», то, что выработалось бы у нас в организме после недели-месяца болезни и связанных с ней мучений. А тут его вам вколют сразу. За антителами будущее.

- Вы создаёте антитела для борьбы с конкретными заболеваниями?

Давно, ещё в лаборатории химии белка ИБХ стали заниматься белком «фактор некроза опухолей» (ФНО). И получили этот ФНО, а потом занялись и антителами к нему. Что такое «фактор некроза опухолей»? Это молекула, которая убивает опухоли. В своё время был большой шум. Было множество публикаций. Его получили, научились in vitro вырабатывать. Но не пошло. Почему? Опухоль – да, убивает, но убивает и печень, гепатоциты. При этом ФНО сам по себе – хороший белок, он вырабатывается в организме человека и в норме. Но лечить рекомбинантным фактором не получается, потому что его становится огромный переизбыток. Даже если превышена концентрация собственного фактора в организме (которого в норме весьма немного), могут возникнуть аутоиммунные заболевания, такие, как псориаз, ревматоидный артрит, болезнь Крона и другие. Когда ФНО борется с опухолью, всё в норме. Но когда он за опухоль принимает что-то другое, вот тогда и начинаются проблемы. Известно, что люди с псориазом практически не болеют раком. Почему? Потому что у них переизбыток этого фактора. Но и плата за это – красные пятна на коже. А антитела к ФНО снимают эти заболевания. Понижают концентрацию фактора в крови. Две-три недели – и псориаза нет. И вот такие антитела с очень хорошими характеристиками были получены уже более 10 лет назад. Но вместо того, чтобы запатентовать изобретение, были просто опубликованы результаты работы. Эти антитела были на тот момент, наверное, самыми эффективными, то есть, они лучше всех связывались с ФНО.

Сейчас существует уже целый ряд аналогичных зарубежных препаратов. А у нас в стране производства такого лекарства до сих пор нет. Тем не менее, мы владеем этой технологией и можем использовать ее для получения других терапевтических антител. Мы можем нарабатывать их как в кишечной палочке – E. сoli, так и в клетках млекопитающих. Правда, не в промышленных масштабах, не столько, сколько вырабатывают фармацевтические предприятия на Западе – с одного литра до 5–10 граммов. Заграничные фармацевтические компании научились вырабатывать антитела в клетках млекопитающих, и это очень важно, потому что когда белки получают в E. сoli, это немножко не то, хотя, в принципе, они тоже работают.

Вообще-то белковые инженеры изначально нарабатывали белки именно в E. сoli, потом начали в дрожжах и других эукариотических клетках, а теперь – в клетках млекопитающих, прежде всего, клетках яичника китайского хомячка (Chinese Hamster Ovary, CHO). Там всё, как у человека. Современно производство основано именно на клетках этих животных.

- А в Вашей лаборатории в чём выращивают антитела?

Мы можем выращивать в тех же CHO по 100 миллиграммов на литр, этого хватает для научных целей.

- Вы и Ваши коллеги занимаетесь мембранными белками, нейротоксинами и антителами?

Не только. Вот есть такой интересный белок – TRAIL. Он похож на фактор некроза опухоли (даже название – TNF-Related Apoptosis Inducing Factor, то есть ФНО-похожий фактор, индуцирующий апоптоз), и тоже вызывает гибель раковых клеток. Этот белок не такой токсичный, как ФНО. Довольно давно уже было сообщение, что он выходит на американский рынок.

- То есть, сотрудники Вашей лаборатории разработали его параллельно с американцами?

Не совсем. Мы немного отстаём. TRAIL был впервые получен не у нас. Но мы сделали свой мутант, который представляет собой комбинацию из других мутантов, он тоже попадает в точку, так как взял полезные свойства от того и другого своего «родителя». Он наш, хотя западный патент его «зонтично» перекрывает, поэтому, если мы захотим выйти на международный рынок, могут возникнуть сложности.

Сейчас при МГУ открывают бизнес-инкубатор. Там будут осуществлять переход от лабораторного масштаба к более крупному, когда можно будет проводить полноценные доклинические исследования на животных. В бизнес-инкубаторе – условия лучше, чем у нас, там всё будет сделано по современным критериям GLP, то есть там можно будет довести технологию производства белка до ума, добиться более высокого выхода, провести доклинику и продать уже протестированный препарат и технологию его производства фармацевтическим компаниям.

- Я знаю, что в Институте есть ещё Отдел структурной биологии. Его сотрудники тоже занимаются изучением белков – мембранных, нейротоксинов и других. Чем Ваша работа отличается?

Мы, естественно, сотрудничаем с другими Отделами и лабораториями ИБХ. Мы выделяем объект изучения – белок. Мы можем получить его в E. сoli или другой системе экспрессии, причём так, что он правильно сворачивается – имеет нативную конформацию. Причём держать, например, мембранные белки, в воде нельзя. Их надо держать в специальной среде, которая как-то моделирует мембрану. Вот мы это сделали, а дальше передаём белок в Отдел структурной биологии, которым руководит Александр Сергеевич Арсеньев, и там исследуют уже строение молекулы на атомарном уровне. С помощью, прежде всего, метода ядерного магнитного резонанса. А потом, когда вы уже знаете, как протеин устроен, вы можете уже моделировать его поведение на компьютере.

- То есть, Ваша лаборатория – как первая ступень в лестнице исследований?

Да. Мы получаем объект. Дальше есть люди, которые изучают его структуру, есть те, которые его моделируют. Но без практической части пока не обойтись. Не всегда прогноз поведения белка подтверждается в реальном эксперименте. В процессе моделирования вы вынуждены вводить константы, переменные, которые известны недостаточно точно. Сейчас отказаться от эксперимента пока нет возможности. Для этого нужно накопить ещё очень большой объём знаний. Не одно десятилетие пройдёт, пока мы сможем проводить исследования только in silico – не создавая белок.

- Есть ли у Вас проекты в рамках соответствующих ФЦП?

У нас несколько проектов в рамках федеральных программ, в частности, по терапевтическим антителам. Мы делаем антитела к интерферону гамма. Есть такая молекула, которая также участвует в воспалительных процессах. Когда её много, могут возникнуть аутоиммунные заболевания. Есть антитела, которые связываются с интерфероном гамма, уменьшая его концентрацию, и, соответственно, развитие воспалительных заболеваний подавляется. Здесь мы довольно близки к мировому уровню, потому что вот только сейчас аналогичный препарат будет выходить на американский рынок. Недавно прошло сообщение, что учёные США провели клинические испытания и доказали, что с помощью антител к интерферону гамма можно лечить одно из таких заболеваний. У нас тоже есть подобный проект.

Помимо ФЦП мы получаем финансирование и из других программ. В частности, хотел бы отметить Программу Президиума РАН по молекулярной и клеточной биологии, которую координирует академик Георгий Павлович Георгиев. Эта программа выделяется из всех остальных тем, что формальная, бюрократическая часть в ней сведена к минимуму: ведущие лаборатории страны получают гранты в соответствии с уровнем своих научных публикаций. Гранты хорошие – несколько миллионов рублей в год. И в этой Программе –чисто научная отчетность: опубликовал результаты в престижных международных журналах, получил хорошие патенты – значит, деньги потрачены не зря. Ведь уровень публикаций говорит о вас лучше любых формальных стостраничных отчетов. Даже на Западе таких, я бы сказал, ориентированных на науку и ученых программ немного, а для нашей страны – это просто уникальное явление, и очень бы хотелось, чтобы эта Программа и дальше развивалась.

И, конечно, мы проводим научные исследования в рамках международного сотрудничества. У нас есть проекты, финансируемые международными организациями. В частности, только что закончился проект 7 Европейской рамочной программы и намечается новый, был совместный проект с французскими коллегами, финансируемый через Международный научно-технический центр (ISTC), проект CRDF и другие проекты. Наука интернациональна, и такое сотрудничество, безусловно, необходимо и позволяет нам держать достойный уровень своих исследований.