В биологических исследованиях прямое наблюдение за микроорганизмами и живыми структурами через микроскоп зачастую сопряжено с повреждением хрупких тканей и даже ДНК изучаемых существ. Это происходит из-за того, что свет, используемый в современных микроскопах, слишком агрессивен для предмета биологических изысканий, и до сих пор попытки уменьшить потенциальный вред без потери качества микрофотографий не приводили к громкому успеху.

Теперь же команда исследователей из США, Европы и Японии разработала новую методику микроскопии, позволяющую наблюдать за микроорганизмами в режиме реального времени, снимать их на видео и не наносить им вреда.

Всё благодаря технологии так называемого «светового листа»: излучение проходит через образец, освещая только отображаемую его часть. Это сводит к минимуму повреждение тканей, вызванное излишней освещённостью, и позволяет делать динамические снимки.

Авторами новой методики (кратко о ней мы уже рассказывали) стала команда во главе с Эриком Бетцигом (Eric Betzig) из Медицинского института Говарда Хьюза, который стал Нобелевским лауреатом по химии 2014 года. Завершив свою работу над микроскопией сверхвысокого разрешения, которая принесла ему Нобелевскую премию, Бетциг решил поработать над видеотехнологиями.

«Изучая статичные изображения биологических структур, можно узнать массу всего нового о живой природе. Но понять её процессы и проследить за ними в динамике позволит только видеозапись», — поясняет Бетциг.

Рис. 1. Новая технология позволяет снимать отдельные клетки со скоростью 1000 кадров в секунду.

Биологам известно, что изучение живых клеток в режиме реального времени чревато смертью этих самых клеток или необратимыми повреждениями их структуры, поскольку необходимый уровень освещения оказывается слишком мощным для хрупких тканей. Традиционные методы визуализации, такие как конфокальная микроскопия, основываются на отправке конического пучка света на образец, который можно сфокусировать на микроскопической точке исследуемой цели.

В ходе наблюдения фокус скользит по плоскости изображения, свет отражается от образца и вновь собирается прибором. Чаще всего повреждения клеток связаны именно с действием концентрированного света на кончике конуса.

Микроскопия «светового листа», доработанная под началом Бетцига, обходит эту проблему путём освещения образца тонким равномерным пластом света, поставленным перпендикулярно направлению визуализации. При прохождении через исследуемый образец световой лист создаёт трёхмерное изображение.

Основа этой технологии была создана раньше, когда Эрнст Штельцер (Ernst Stelzer) и его коллеги из Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге впервые использовали световой лист для наблюдения за эмбрионами мух. К сожалению, учёным не удалось создать «лист» тоньше, чем 5 микрометров, в то время как глубина фокуса микроскопа с высокой разрешающей способностью составляла около 1 микрометра. Это означает, что большая часть света, проходившего через образец, размывала изображение вместо того, чтобы увеличивать его чёткость и резкость.

Бетциг и его коллеги доработали методику и решили проблему, которую не удавалось решить Штельцеру. Новая технология подразумевает освещение образца плоскими волнами света из нескольких источников в разных направлениях. Интерференция этих волн образует тонкую оптическую решётку стоячих волн, похожую на ту, что используется для заключения в ловушку ультрахолодных атомов. А чтобы получить изображения в самом высоком разрешении, исследователи взяли несколько изображений в каждой плоскости, постепенно смещая решётку через плоскости, после чего объединили все снимки в электронном виде.

Рис. 2. Отдельная клетка HeLa в метафазе, визуализированная решетками светового листа.

Учёные сообщают в пресс-релизе, что они также разработали методику для получения изображений гораздо быстрее обычного и с меньшим количеством света, проходящим через образец. Для этого необходимо передвигать решётку вперёд и назад очень быстро, в результате чего освещение распределится равномерно по плоскости световым листом толщиной всего в один микрометр.

Испытания методики показали, что микроскопия «светового листа», дополненная модификациями Бетцига и его коллег, позволяет создавать видео о скоростью 1000 кадров в секунду. Так получаются записи мельчайших биологических процессов, которые можно изучать во всех подробностях, прокручивая видео с любой скоростью без потери данных. О впечатляющих результатах своей работы учёные рассказали в статье журнала Science.

Биологи уже успели оценить разработку команды Бетцига. В тестовом режиме учёные использовали микроскопию «светового листа» для того, чтобы запечатлеть поведение митохондриальных фрагментов и хромосом в ходе деления клеток и их развития у эмбрионов мух и червей. Также для эксперимента были использованы так называемые «бессмертные» клетки HeLa: эти организмы способны делиться бесконечное количество раз, и потому являются прекрасной моделью для биологических исследований.

В целом, микроскопия «светового листа» должна перевернуть представления не только о фундаментальной биологии, но и о практической медицине. Технология, позволяющая следить за микропроцессами в режиме реального времени, облегчит проведение анализов, а значит, и диагностику заболеваний.