Технология

Геномное редактирование по своей сути это простая идея — осмысленно сделать изменение в определенной области генома организма, обычно в гене. Эта мутация (изменение в последовательности ДНК гена) приводит к изменению в белке, кодируемом этим геном, что выливается в физически-заметную особенность в организме. За последние 4 года геномное редактирование стало известным и знаменитым; практически все СМИ от Guardian до КП упомянули про это, было несколько лекций TED, статьи на технических сайтах и что, возможно, еще важнее на Buzzfeed.

В свете недавно принятого запрета на ГМО (пост) тема генной инженерии у всех на слуху. Предлагаю вам перевод отличной статьи, которая описывает историю биотехнологий в сельском хозяйстве и поднимает вопрос о применимости термина ГМО к продуктам техник нового поколения. Это дает надежду на применение новых организмов без ада бюрократии и паники среди населения.

В научной среде геномное редактирование стало магнитом для грантов, публикаций и цитирований — святой троицы современной науки. Причина столь значительного интереса лежит в недавнем открытии и совершенствовании технологии CRIPSR/Cas9, простого средства, сделавшего геномное редактирование доступным для большей части биологических лабораторий по всему миру. За 4 года с момента дебюта CRIPSR применили для редактирования клеток человека, злаков, насекомых (например бабочек), дрожжей и многих других.

Ученые из Корнелльского университета недавно отредактировали геном бабочек из рода Ванессы для поиска генетической основы в образовании «глазков» на крыльях.

До CRIPSR было практически невозможно создать мутацию только в целевом гене и сделать это с относительной легкостью. Неспециалисту достаточно сложно объяснить насколько продвинут CRIPSR по сравнению с более ранними техниками редактирования генома; это можно сравнить с технологическим скачком от предков двигателей к ДВС. Конечно же весь этот разговор о целевых мутациях поднимает вопрос «а зачем бы нам вообще это делать?».

С того момента, как стал известен геном человека, биологам удалось узнать много нового о генетике болезней. Например мы знаем, что болезнь Хантингтона (неизлечимое генетическое расстройство) вызвана слишком большим количеством C-A-G оснований в последовательности гена HTT. Или что серповидно-клеточная анемия вызвана одной заменой A->T в гене гемоглобина (белка, делающего кровь красной и связывающего кислород). Однако сделать с этим особо ничего нельзя, за исключением диагностики и генетических консультаций. Представьте себе фрустрацию, которую должно быть чувствуют доктора, зная причину болезни и не имея возможности ничего сделать. А с CRIPSR мы, возможно, сможем понять как правильно отредактировать эти гены и исправить мутации, вызвавшие болезни. И это лишь малая часть возможностей редактирования — не говоря уже об онкологических и вирусных заболеваниях.

Как и в случае любых новых биоинженерных техник прежде всего CRIPSR стараются применить для медицины. Но, хотя эти возможности стремительно разрабатываются в лабораториях по всему миру, до реального применения им еще далеко. А вот отрасль, которая может быть практически сразу изменена CRIPSR и редактированием в принципе это агротехнология.

Природная вариабельность

История геномного редактирования в сельском хозяйстве должна начинаться с рассказа об естественной генетической вариабельности и её пределах. Большая часть растений имеют весьма значительный процент общей ДНК; этот факт выглядит очевидным если посмотреть насколько много базовых физиологических функций (от фотосинтеза до размножения) объединяют разные виды растений (да и вообще говоря большая часть живых существ имеют достаточно много общей ДНК). Однако те же самые гены, даже внутри одного и того же вида могут отличаться; это отличие может быть и таким малым как замена одного нуклеотида на другой, так и таким крупным как потеря целого куска гена. Гены могут быть представлены в виде одной или более копии в геноме или же вообще отсутствовать (что тоже по сути мутация, только крупнее). Что я тут пытаюсь донести, так это то, что хотя очень многие гены одинаковы внутри видов и между видами, большинство из них все же имеют небольшие различия или мутации. Эти мутации в основном — результат эволюции и эти разные версии одного и того же гена называются аллелями. Это разнообразие аллелей может изменить функции генов самым разным образом — от его выключения совсем до изменения того, что собственно делает этот ген.

В таком ключе вся история сельского хозяйства — это попытки выбрать наиболее подходящие и отбросить менее полезные аллели для селекционной работы.

Обычно фермеры и селекционеры делают это мучительным и не самым эффективным образом — изучают большие популяции растений и скрещивают их друг с другом до тех пор, пока не получат растение, имеющее правильную комбинацию «полезных» аллелей разных генов. И естественно, что хорошо для одной популяции, может быть плохим для другой, что делает доступность генетического разнообразия очень важной.

Сохраняем разнообразие

Всемирное семенохранилище на о. Шпицберген, одно из самых крупных в мире (Фото:Mari Tefre/Svalbard Globale frøhvelv)

Существование большого разнообразия и изменчивости аллелей является фундаментальным для процесса скрещивания. Фактически, без большого набора разных вариантов генетического материала скрещивание вообще не имело бы смысла (получалось бы одно и то же прим. пер.). Радует то, что фермеры и ученые понимают важность биоразнообразия и в примерно 1300 специальных хранилищах размещены семена примерно 6 миллионов вариантов (сорта и виды) растений. При всем при этом, сохранение вариабельности это не то же самое, что и ее использование. Селекционеры часто используют «диких» родственников культурных растений и старые результаты скрещиваний как источник новых аллелей, в то время как большое количество материала в семенохранилищах остается неописанным и неиспользованным.

Новая инициатива DivSeek (возглавляемая учеными и экспертами в области биоразнообразия из 65 организаций по всему миру) направлена на решение этой проблемы. DivSeek предполагает описание генома и фенотипа (того, как этот генотип реализован в конкретном растении) образцов, представленных в хранилищах и представление полученных данных в открытом доступе. Это очень амбициозный проект, даже выбор того, какие из миллионов образцов тестировать уже трудный вопрос. Побочными продуктами выполнения этой задачи могут стать 1) снижение цены секвенирования ДНК 2) автоматизированные пайплайны для изучения фенотипов с большой пропускной способностью и 3) распространение и обмен информации между фермерами. Это недавняя инициатива рассчитана на длительный срок и начала работу совсем недавно, но её успех может означать новую эпоху в исследовании разнообразия культурных растений.

Создание разнообразия

Пропагандистский плакат программы Эйзенхауэра Atoms for Peace. По National archives

Малоизвестен факт, что значительное количество современных популярных сельхоз видов растений были получены как результат программы исследования мутагенеза в начале и середине XX века; частично это побочный продукт развития ядерных технологий и гос программы США Atoms for Peace.

Классический мутагенез для создания вариативности в растениях заключается в создании мутаций в семенах либо рентгеном/гамма-излучением или с помощью химических мутагенов. Эти мутагены вызывают повреждения ДНК растения и восстановление этих повреждений приводит к созданию новых, мутантных аллелей. Полученные аллели могут быть как уникальными, так и на деле уже существующими в природных растениях (например не в тех, где делают мутагенез). Мутация с помощью такой технологии неточная, происходят несколько миллионов мутационных событий в геноме, при это только некоторая их часть нужна для скрещивания. Поэтому первичные продукты мутагенеза должны пройти селекцию и серию скрещиваний для того, чтобы отобрать потенциально полезные аллели и привнести их в существующий вид культурного растения; этот процесс длительный и может занимать десятки лет. Мутационная селекция поэтому и дорогая, и занимает кучу времени, но при этом все-таки создает дополнительные аллели и, соответственно, разнообразие. Некоторые из таких продуктов такой мутационной селекции до сих пор широко применяются, например карликовая пшеница (dwarf wheat), знаменитая благодаря Зеленой Революции, карликовый рис в Калифорнии, резистентный к вирусам кокос в Гане и злаки, которые лучше проходят соложение, в Европе.

Геномное редактирование это другая форма мутагенеза. Важное отличие здесь в том, что старые методики опираются на случайные события, в то время как геномное редактирование точное и целенаправленное, что приводит к резкому снижению временных затрат от мутации к посеву опытных растений.

Новое сельское хозяйство

Селекцию растений даже сейчас описывают в учебниках как “искусство и наука”. Во многом потому что зависит от навыков специалиста по селекции для выбора различных свойств растений — так называемый breeder eye. Еще традиционное скрещивание требует огромного количество времени и ресурсов, так как использует переборные подходы к поиску новых свойств растений и созданию видового разнообразия.

Во многом все происходит именно так потому что у нас есть пробелы в биологии определенных свойств, эти пробелы будут заполнены уже следующими поколениями биологов но, несмотря на отсутствие таких знаний в прошлом, это не помешало проделать потрясающую работу селекционерам по созданию разнообразных растений и увеличению урожаев.

История селекции растений представляет собой развитие от “черного ящика” к более полному пониманию того, что делает растение и как лучше использовать их уникальные свойства. Наши предки поняли что высаживание семян растений, которые имели больше фруктов или меньше заболеваний, давало им больший урожай в следующем сезоне, но они оставались слепы в вопросах биологии размножения. Значительно позже, в 17 веке, мы поняли больше о том, как растения воспроизводятся и начали проводить искусственные скрещивания. Вскоре после этого пришли Дарвин и Мендель давшие нам идеи естественного отбора и законы генетики и все это в течение 50 лет! И теперь, с недавним распространением -omics технологий, мы можем читать ДНК растений, изучать как каждый ген отвечает на различные условия среды и предсказывать насколько эффективно растение может производить химические вещества ради которых мы их и едим. Эти знания становятся еще более полезными в случае с геномным редактированием.

Как только селекционер или ученый нашел полезную аллель, с помощью геномного редактирования они смогут перенести его в другой сорт или даже вид растений практические немедленно, без необходимости получения серии поколений.

В будущем геномное редактирование может изменить процесс получения новых свойств (аллелей) как таковой. Геномное редактирование на базе CRIPSR может быть использовано для одновременного редактирования каждого гена в геноме растений (или каждого гена определенного типа — например R-гены которые отвечают за устойчивость к заболеваниям) таким образом создавая множество информации и потенциально открывая полезные аллели, которые можно вставить обратно в уже применяющиеся сорта растений. Настоящая же вершина редактирования генома с помощью CRIPSR заключается в возможности создания различных аллелей, отделенного от полового размножения.

Геномное редактирование может, как мне кажется, обеспечить plug-and-play модель селекции растений.

Селекционный пайплайн будущего будет по моим прикидкам похож на современные конвейеры. Взяв на вооружение данные из 1000 научных статей и инициатив таких как DivSeek, исследователи будут тестировать различные комбинации аллелей в модельных сортах растений напрямую редактируя их геном, возможно с помощью специалистов по предсказательному анализу и математическому моделированию. После отбора аллелей на основе этих результатов, ученые смогут использовать эти изменения на большом количестве немодельных сортов растений, провести тесты в поле и приступить к производству семян новых сортов. Хотя факторов, влияющих на процесс достаточно много, наибольший эффект в сельском хозяйстве даст уменьшение количества требуемых поколений для теста нового сорта. Иными словами более быстрое создание продукта.

Студенты изучающие иммунитет растений, знакомы с зигзагообразной моделью коэволюции растений и вредителей. Эта модель описывает гонку вооружений между растением и патогенами, которые его атакуют, причем многие из них быстрее приобретают эволюционные изменения нежели растение. Задача современного сельского хозяйства на это похожа. Индустрии надо прокормить увеличивающуюся популяцию людей, справиться с влиянием изменений климата ( увеличивающееся количество экстремальных природных явлений в короткой перспективе и глобальное изменения климата в более далеких перспективах) помимо этого справляясь с быстро-изменяющимися вредителями и все это с требованием к устойчивости получившейся системе.

Когда же будет общество всеобщего достатка?

Сельское хозяйство, конечно, встречалось с подобными проблемами в прошлом, например особенно широко известна Зеленая революция, опровергшая предсказания Пауля Эрлиха. Это революция стала возможной только благодаря тому что ее возглавил лауреат Нобелевской премии мира Норман Борлауг, представивший новые сорта растений и инструменты механизации для фермеров.

Сейчас мы встретились с теми же самыми препятствиями, но с даже более масштабными и оставаться на месте значит двигаться назад

Многое из того что есть обсуждал, обсуждалось и раньше, в момент появления новых сельскохозяйственных технологий: от гибридизации злаков и генетической инженерии до селекции с помощью маркеров. Некоторые из этих технологий были приняты; но генетическая инженерия остается монополизированной несколькими большими компаниями, отвергаемая многими нациями и рассматривается лишь в далекой перспективе. Какая судьба ожидает геномное редактирование?

Подождите-ка, это ГМО?

Этот вопрос мне постоянно задают, когда я говорю о геномном редактировании, и с точки зрения государственного регулирования это тот вопрос, который полностью определяет судьбу этой технологии в сельском хозяйстве (я не хочу вступать в дебаты о регуляции ГМО в этой статье, и предполагаю что ситуация пока что не поменяется в ближайшем будущем, особенно в Европе).

Отвечая на исходный вопрос: я так не думаю — по той простой причине, что вы не сможете определить разницу между отредактированным растением и естественным вариантом, встречающимся в природе. Результат геномного редактирования обычно не содержит никаких трансгенов (тех генов которые взяты из другого организма, в природе не встречаются в модифицируемом) и, по всей вероятности, и не будет никаких следов применения метода, которым получен сорт отредактированного растения. Это ставит удивительную проблему для регуляторов и общественных групп, которые хотели бы считать редактирование одной из форм создания ГМО (т.е. применять к ней те же законы). Как вы можете регулировать эту область, если вы не знаете к каким растениям (природное ли оно или созданное?) относится закон, а к каким нет? Вы, конечно, можете проверять селекционные компании и лаборатории или попытаться сделать процесс получения базовых реагентов очень сложным (непростая работенка), но этого ли надо обществу, следить за частными фирмами и учеными, не связанными с бизнесом? Организации типа Гринписа или Friends of the Earth, как и “органическая индустрия” хотят зарегулировать продукты геномного редактирования, но я не видел ни одного внятного предложения, как бы можно это было организовать.

А теперь на более фундаментальном уровне, как именно геномное редактирование отличается от случайного мутагенеза? Редактирование проводится с помощью биохимических агентов (РНК и белки), которые действуют более точно нежели УФ или химические мутагены; главное, что конечный продукт тот же самый — растение с новой аллелью. Теперь вы возможно захотите считать случайный мутагенез процессом генетической модификации. И вы будете абсолютно правы, так как происходит модификация генетического материала растений. Но, важно понимать, что страны делают исключения для случайного мутагенеза по двум причинам: а) это та часть современного сельского хозяйства от которой вообще никак нельзя уйти (включая органическое сельское хозяйство) и б) результат тоже никак нельзя отличить от природной вариации. Поэтому мы ведем спор ни о чем, пытаясь классифицировать результат одной технологии как ГМО, а второй как не-ГМО. Для ученых очевидно, что разделения на ГМО/не-ГМО вообще нет в природе.

Обратно к нашему вопросу: “ГМО ли это?” — технически, да (как и многие растения, выращиваемые “органическими” фермерами по всему свету). “Важно ли это?” Не-а.

Кто будет владеть этими растениями?

Другой частый вопрос, который мне задают когда я описываю мой текущий проект по созданию трансгенного растения — “Это будет запатентовано?”. Много критических замечаний направлено на защиту интеллектуальной собственности (сортов растений) как например

Гринписовское: “Существующие живые организмы — растения и животные, так же как и их гены, ничье изобретение и поэтому они никогда не должны быть запатентованы или отданы под частный контроль”. В этом заявлении неявно подразумевается, что те культуры, что мы сейчас используем “ничьи разработки”. В ответ на это я надеюсь, что явно показал, насколько сельское хозяйство зависит от навыков и изобретательности фермеров, селекционеров и да, современных биотех компаний. На картинке с кукурузой вы можете посмотреть как человеческая изобретательность создала систему, способную прокормить больше людей каждый день.

Слева изображен теосинте — генетический предшественник кукурузы, а справа привычная одомашненная кукуруза. (с) John Dobley

Право на интеллектуальную собственность чрезвычайно важно в развитии современных технологий и юридические обстоятельства сыграют значительную роль в применении геномного редактирования в сельском хозяйстве.

Краткое описание систем защиты ИС в США и Европе

Изобретатель нового сорта растения обычно имеет два варианта для защиты — plant variety protection (PVP) или патент (обычно патент на использование в США). Патенты подразумевают большую степень научной новизны и в основном используются биотехнологическими корпорациями для защиты семенного материала с помощью патента на ДНК последовательность либо на свойство, которое было добавлено в растение. PVP используется селекционерами использующими традиционные методы; там менее строгие критерии новизны, но и чуть меньше степень защиты. Например патент не разрешает фермерам использовать семена для повторного засеивания или селекционерам создавать новые сорта на основе запатентованного, в то время как PVP это разрешает. В США, в отличие от многих стран, разрешены патенты на селекционные сорта, так же как и методы создания растений, так как они и удовлетворяют критерию новизны и неочевидности.

На патенты определенно есть спрос! Запросы — синяя линия, полученные патенты — красная. По NoPatentsOnSeeds

В Европе селекционеры обычно получают PVP так как там патенты не выдают на “по сути биологический процесс селекции”. Однако ситуация не такая и простая (см. график) и недавнее решение Европейского патентного офиса (EPO) вводит разницу между процессом получения новых сортов (их нельзя патентовать) и результатов (а вот их вроде как можно). Например EPO выдали патент Израильскому министерству сельского хозяйства на томат, устойчивый к засухе, полученный традиционными методами селекции. Стоит подождать решения Еврокомиссии, которая пообещала разобраться с этой ситуацией, в данный момент они работают на юридически-обязывающей интерпретацией, которая может запретить патенты на выведенные сорта.

На данный момент в Европе результаты генной инженерии можно запатентовать, а результат традиционной селекции — нет. Эта ситуация несколько головоломна, потому что если регуляторы сочтут что геномное редактирование не-ГМО техника, то можно ли будет сделать патент или придется ограничиться PVP? С одной стороны, если считать это генетической модификацией (потому патентуемой) то как заявитель докажет что его организм уникален (то есть не существует аллели в природе, которая бы совпадала с заявляемым организмом)?

Другой момент связан с тем, как патенты влияют на распространенность определенных технологий. Патенты дают изобретателю монополию на определенное время (20 лет в США). Это не ограничивает возможности по применению генетически модифицированной ДНК в других сортах растений другими селекционерами, если другой селекционер не купит на это лицензию. Но если “редактированные” растения будут подходить по требованиям к PVP то аллели этих растений могут (и скорее всего будут) широко использованы другими селекционерами и фермерами. Поэтому вопрос будет ли индустрия требовать начальных вложений для запуска проектов с редактированным геномом остается в силе.

Откуда возьмутся деньги?

Практически каждая агробиотех компания сегодня вкладывает деньги в редактирование как минимум нескольких растений. Например небольшая компания из США Cibus уже планирует выпустить рапс, устойчивый к гербицидам в этом году. Хотя именно это растение разработано с помощью другой, более старой технологии, с уверенностью можно сказать, что новые разработки будут опираться на CRIPSR технику. В данный момент патенты на CRIPSR у Broad Institute MIT и у Гарвардского института, у DuPont и еще у нескольких организаций. Насколько я понимаю, наиболее сильные позиции в агробиотехе у DuPont и Caribou Biosciences (спин-офф из Беркли). Но с другой стороны технология быстро развивается и появляются новые методы из других университетов и компаний.

Ключевой момент здесь состоит в том, что если патентная защита распространяется только на метод получения продукта, но не на сам продукт, то готовы ли компании вкладывать деньги в редактирование. В США, где продукты можно патентовать ситуация иная, но например Монсанто получает ~40% выручки не в США, значит это все равно актуальный вопрос даже для Америки. Для компаний вне США все это еще важнее. Возможно потребуется более продуманная защита интеллектуальной собственности для поощрения инноваций в этой среде.

Первые шаги

Некоторые моменты в статье несколько спекулятивны, но на удивление большая часть — нет. Редактирование генома с помощью CRIPSR было проведено в самых разнообразных растениях — рис и пшеница, помидоры и салат латук. Отредактированные растения уже все ближе к выходу на рынок: как Cibus, так и DuPont уже проводят испытания в поле.

При всем этом специалистам по растениям все еще надо дальше разрабатывать средства, которые позволят вести разработку по модели “plug and play”, про которую рассказывал выше. Первый этап геномного редактирования это устойчивая генетическая трансформация и регенерация “раздетой” растительной клетки (протопласта) и на мой взгляд недостаточно научных проектов работают над этой базовой задачей о культивировании тканей растений различных видов. Так же нам надо улучшить системы предсказания результатов генетических интервенций в определенном гене или геномном регионе; возможно полногеномные модели смогли бы помочь в этом. Нам нужны более производительные фенотипирующие системы, например single-cell системы для проверки на иммунные реакции. В этом надо брать пример с биомедицинского сообщества, где например микрофлюидные системы для культивирования культур клеток, но для растений? Стоимость секвенирования генома человека упала до1000$ за геном и еще падает до100$/геном. Аналогичный прогресс нужен и для растений, возможно даже больший, так как их геномы более сложные чем у человека.

Абсолютно ясно, что широкое распространение геномного редактирования в сельском хозяйстве зависит от того, как будет эта технология регулироваться. Как приверженец этой идеи я считаю, что США на верном пути со своими системами регуляции и защиты интеллектуальной собственности. Дискуссии в Еврокомиссии также очень значимы ввиду важной роли ЕС в ФАО и Всемирной организации интеллектуальной собственности, пускай Европа и производит не так уж и много еды.

Учитывая рост населения и динамику изменения климата понятно, что текущими технологиями накормить мир не выйдет. Наиболее сильный удар придется по наиболее бедным южным странам, экономики которых не могут субсидировать сельское хозяйство как в развитых странах. Возможно, что для создания более устойчивого сельского хозяйства стоит быть более открытым новым технологиям и не концентрироваться на менее эффективных. Скорее всего не выйдет уменьшить количество потребляемой еды, но можно увеличить эффективность с которой мы её производим.