Группа исследователей кафедры биомедицинских систем МИЭТа под руководством доктора физико-математических наук Сергея Терещенко, изучая особенности распространения лазерного излучения через различные биологические рассеивающие среды, занималась сначала определением коэффициентов рассеяния и поглощения для объектов, имитирующих биологические ткани, такие, как человеческая кожа или мышцы, а затем перешла к изучению флуоресценции, рассматривая биологические объекты с теми же самыми оптическими свойствами, но при источнике излучения, расположенном не снаружи, а внутри, — флуорофоре. Применением флуорофоров в иммунодиагностике заинтересовался сотрудник кафедры, кандидат физико-математических наук Сергей Долгушин; он-то и возглавил проект «Биолюмикс».

Разработанный метод предполагает мультиплексное выявление IgG-иммуноглобулинов. Технология мультиплексного выявления антител (т.е. одновременного выявления как минимум двух инфекций) известна давно. Она основана на использовании спектрально кодируемых микросфер (например полистирольных) с присоединенными к их поверхности распознающими молекулами-зондами. Каждая микросфера — отдельный элемент биочипа, распознаваемый по уникальному, заранее заданному спектральному коду, и характеризуемый присоединенной к его поверхности уникальной распознающей молекулой. Так происходит точечная регистрация именно того химического соединения (в данном случае — IgG-антитела), на идентификацию которого направлен элемент биочипа. Анализ проходит на автоматах, использующих принципы проточной цитофлуориметрии. Стандартный метод проточной цитофлуориметрии основан на регистрации оптического излучения, однократно рассеянного на одиночной частице. Метод требует сравнительно простой системы регистрации и анализа сигнала и дает быстрый результат.

«Биолюмикс» взялся за реагенты для тестирования на так называемые TORCH-инфекции, диагностику которых проводят главным образом у новорожденных и беременных: при первичном заражении эти инфекции способны преодолеть плацентарный барьер и привести к поражениям организма матери и плода, они также повышают риск выкидыша и мертворождения.

Для проведения теста нужно всего 20 мкл крови. Разведенную сыворотку крови смешивают с суспензией полистироловых микросфер, кодированных органическим красителем в различной концентрации. При наличии в сыворотке крови иммуноглобулинов IgG, специфических к антигенам (АГ) патогенов, в реакционной смеси происходит образование комплексов АГ- специфическое антитело (например, АГ (CMV) — IgG или АГ (Toxo) — IgG). Этот процесс занимает около 30 минут. Затем происходит отмывка суспензий микросфер от избытка сыворотки, добавление конъюгата — на этом этапе инкубация занимает 20 минут. При этом на поверхности микросфер происходит образование комплексов АГ — специфическое антитело — конъюгат (например, АГ (CMV) — IgG — Kr). На последнем этапе проводят отмывку суспенсзий микросфер от избытка конъюгата; анализ суспензии проводят на любом проточном цитофлуориметре.

В случае наличия в сыворотке крови IgG, специфических к антигенам T. gondii, вируса краснухи, ЦМВ (цитомегаловирус) или ВПГ (вирус простого герпеса), в пробе происходит реакция связывания антигена, иммобилизованного на поверхности микросферы, и специфического антитела. Затем суспензию микросфер промывают, добавляют в нее конъюгат с антителами, специфическими к IgG человека и меченными флуоресцентным маркером (в «Биолюмикс» — фикоэритрин). Так формируется комплекс антиген — специфическое IgG — антитело — конъюгат.

Как работают флуорофоры
Сначала их облучают светом на длине волны возбуждения (для каждого типа флуорофора она своя), а затем они сами испускают свет на другой длине волны, причем спектр флуоресценции оказывается сдвинут в сторону более длинных волн. Источником излучения может быть лазер или лампа, его длина волны должна быть предельно близка к максимуму спектра поглощения флуорофора: флуоресценция — крайне слабый процесс, и у лучших органических флуорофоров квантовый выход (отношение числа испускаемых фотонов к числу поглощенных) не превышает 1%.

Кроме микросфер, связывающихся со специфическими антителами, в смеси присутствуют микросферы, контролирующие рабочее состояние конъюгата. Такие сферы несут на своей поверхности моноклональные IgG человека, после их взаимодействия с конъюгатом формируется комплекс IgG — конъюгат. Таким образом контролируются все этапы проведения реакции, и в случае отсутствия флуоресценции на данном типе микросфер анализ нужно повторить.

Зарегистрировать наличие в исследуемой сыворотке крови специфических IgG к искомым инфекциям можно по появлению в спектре флуоресцентного излучения из микросферы. Один пик флуоресценции, соответствующий длине волны флуоресценции органического красителя, которым кодирована эта микросфера (609 нм), есть всегда. А вот другой пик, соответствующий длине волны фикоэритрина (575 нм), и говорит о наличии инфекции. Результаты иммуноанализа при этом не являются основанием для диагноза, а только помогают в определении заболевания, его стадии.

Сейчас набор реагентов «Биолюмикс-TORCH» служит для выявления антител класса G: данные этого теста можно использовать только для подтверждения/опровержения факта перенесения заболевания в прошлом. Таким образом, «Биолюмикс-TORCH» становится составной частью комплекса анализов на выявление маркеров TORCH-инфекций.

Кроме проточных цитофлуориметров, которые есть почти во всех крупных частных и государственных лабораториях, никакого сложного оборудования для «Биолюмикса», не требуется. Стоимость же набора «Биолюмикс» на 96 определений не превышает стоимости четырех отдельных наборов для иммуноферментного анализа.