Как «тепловизоры» змей помогают нейрофизиологам, зачем ученые нагревают контейнеры с дрозофилами и как изобретение советских физиков помогает нейроученым, рассказал профессор РАН Всеволод Белоусов.

Сотрудники Института биоорганической химии РАН совместно с коллегами из Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН и МГУ разработали метод стимуляции нервных клеток инфракрасным излучением, встраивая в нейроны белки-терморецепторы змей. Опубликованные сегодня в журнале Nature Communications результаты помогут неинвазивно стимулировать нейронные сети в глубоких слоях тканей, а также управлять активностью других типов клеток в живых системах. Научный редактор портала Indicator.Ru и главный редактор портала Neuronovosti.ru Алексей Паевский поговорил с ведущим автором этой работы.

— Всеволод, откуда появилась идея такого вмешательства в строение нейронов?

— Здесь нужно сказать несколько слов предыстории. Вот уже около десяти лет в нейронауках важнейшим инструментом стала оптогенетика. Оптогенетика (от англ. optics + genetics) является совокупностью технологий, позволяющих управлять активностью нейронов с помощью света (optics) и встроенных в нейроны светочувствительных ионных каналов, закодированных на уровне ДНК (genetics). Оптогенетика позволяет активировать или, наоборот, деактивировать нейронные контуры, отвечающие за различное поведение животных, обучение, память, тем самым помогая выяснять, какие именно группы нейронов отвечают за ту или иную функцию. Чаще всего в оптогенетике используются так называемые каналородопсины, светозависимые ионные каналы из водорослей.

— Это только чистый эксперимент или оптогенетика может иметь практическое применение в медицине?

— Молекулярные инструменты оптогенетики имеют большой терапевтический потенциал, например, уже сейчас идут клинические испытания по терапии пигментозного ретинита с помощью опсинов.

— Но, как обычно, здесь есть «но». Давайте сразу перейдем к нему.

— Ну, а куда без «но». У оптогенетики есть несколько недостатков: во-первых, видимый свет, которым активируются каналородопсины, плохо проходит через биологические ткани. Это делает невозможным стимуляцию нейронов в глубине ткани.

Во-вторых, проводимость каналородопсинов низка, поэтому для того, чтобы активировать нейронный контур, необходимо использовать свет высокой мощности (обычно это синий лазер). Это способно вызывать фотоповреждение нейронов.

В-третьих, если для активации нейронов мыши используются оптические волокна, имплантированные прямо в ткань мозга, то другие классические объекты нейробиологии, мальки Danio rerio и плодовая мушка Drosophila melanogaster, освещаются снаружи, и они способны видеть свет, которым их активируют. То есть помимо специфического ответа, мы получаем еще возбуждение зрительных зон мозга – и порой сложно отделить один сигнал от другого в эксперименте.

— И как эти проблемы решали ваши предшественники?

— Были попытки частично решить эти проблемы при помощи хемогенетики. Есть ионные каналы, активируемые определенными химическими веществами. У них хорошая проводимость, но после введения активирующего вещества активируемые нейроны остаются «включенными», пока вещество не выведется из организма.

Другой подход, термогенетика, заключался в использовании ионных каналов, реагирующих на нагревание. Он использовался в экспериментах на дрозофилах: для активации нейронов воздух в контейнере с мухами подогревался, нагревая все животное. При этом нагрев и остывание происходит медленно, и, как и в случае с хемогенетикой, невозможно активировать отдельные нейроны, экспрессирующие нужный ионный канал, а только все сразу. Поэтому оптогенетика несомненно превосходила эти альтернативные подходы в высоком временном (миллисекундная шкала активации) и пространственном разрешении (десятки микрометров).

— Получается, вы сделали метод, который объединил разрешение оптогенетики и термогенетический принцип?

— Именно! В нашей работе мы разработали молекулярный и физический инструментарий для того, чтобы вывести термогенетику на уровень пространственно-временного разрешения, не уступающего оптогенетике. В качестве ионных каналов, рецепторов, мы взяли термочувствительные каналы семейства TRPA1 из змей.

У многих видов змей, например гремучих змей и щитомордников, есть так называемое термозрение, фактически, прибор ночного видения. У них на носу специальный орган — ямка, насыщенная окончаниями нейронов, несущих в своей мембране рецепторы TRPA1. Эта ямка является, по сути, тепловизором, позволяющим змее охотиться и ориентироваться в темноте.

Структура гена TRPA1. Nature

Рецепторы TRPA1 исключительно чувствительны к тепловому инфракрасному излучению, позволяя змее чувствовать теплокровную добычу на расстоянии нескольких метров. Встраивая змеиные термоканалы в нейроны мыши или рыбки данио рерио, мы наделяли клетки чувствительностью к нагреванию.

— Но вы же не греете целиком аквариум с рерио?

— Нет, конечно [смеется]. Для этого Александр Прохоров с Николаем Басовым (советские физики, основоположники квантовой электроники, — прим. Indicator.Ru) создали лазеры, в том числе и инфракрасные. В качестве источника нагрева мы использовали инфракрасные лазеры, излучающие в диапазоне от 1 до 1,5 мкм. Инфракрасное излучение гораздо глубже, по сравнению с используемым в оптогенетике видимым светом, проникает в ткань, и оно не фототоксично.

Кроме того, варьируя длину волны, можно менять степень поглощения ИК-излучения тканью, и тем самым варьировать глубину и интенсивность нагрева. Импульсное лазерное излучение позволяет активировать нейроны заданной частотой импульсов.

— Как я понимаю, в этой работе было много технических сложностей. Можно ли подробнее рассказать о деталях?

— Перед нами стояла задача нагревать нейроны импульсным ИК-лазером, но так, чтобы в ответ на каждый импульс мы получали локальный нагрев области размером в несколько десятков микрометров на температуру, не превышающую 1–2°C. Недостаточный нагрев не позволил бы активировать нейрон. Избыточный нагрев приведет к гибели нейронов. Как измерить температуру точно и локально? Как откалибровать оптическую установку так, чтобы мощность лазера соответствовала необходимым температурам нагрева?

Для решения этих задач мы использовали квантовый термометр — микроскопический алмаз, в кристаллической решетке которого присутствуют так называемые NV-дефекты. В некоторых положениях решетки вместо углерода находится атом азота (N), а соседняя позиция пустует, т.е. валентна (V). Такой микроалмаз помещается на кончик оптического волокна, через которое он освещается видимым светом. Кроме того, к алмазу подводится локальный генератор СВЧ.

Взаимодействие ИК-излучения алмаза с СВЧ-излучением зависит от температуры, и это взаимодействие можно видеть по параметрам ИК-спектра. Помещая этот зонд в непосредственной близости от клетки, можно измерить, какая мощность ИК-лазера необходима для локального нагрева на заданную температуру. Работы по ИК-фотонике и квантовой термометрии велись совместно с лабораторией Алексея Желтикова в Московском государственном университете.

Наконец, оценить, что именно происходит с мембраной нейрона при нагреве, с какой скоростью происходит деполяризация мембраны, как генерируется потенциал действия, можно исключительно методами классической нейрофизиологии, помещая в клетку электрод и прописывая токи через мембрану при активации TRPA1. Эти эксперименты позволили установить, что с помощью импульсного излучения мы можем генерировать потенциалы действия с частотой до 50 Гц. Это свидетельствует о том, что рецепторы, которые мы используем, не уступают по своим временным характеристикам каналородопсинам, используемым в оптогенетике. Эта часть работы была выполнена в сотрудничестве с группой Евгения Никитина из Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

— А какие эксперименты вы ставили с реальными организмами?

— Значительная часть экспериментов по характеризации каналов TRPA1 змей в клетках млекопитающих и по квантовой термометрии была выполнена на культуре нейронов мыши. Но хороший метод должен работать и на уровне живого организма.

В мальке рыбы данио есть так называемые соматосенсорные нейроны, ответственные за чувствительность к прикосновениям. Их активация приводит к реакции избегания: рыба пытается уплыть, делая быстрый взмах хвостом. Мы получили мальков, которые несут в соматосенсорных нейронах ген TRPA1 гремучей змеи. В таких мальках получалось активировать реакцию избегания, не прибегая к механическому воздействию, но активируя нейроны инфракрасным лазером с диаметром светового пучка 60 мкм. Контрольные рыбы, не несущие ген TRPA1, были нечувствительны к воздействию ИК-излучения.

— Можно пару слов про финансирование работы?

— В данном проекте исключительно важен именно его междисциплинарный характер. Исследование не носило бы завершенный характер, если бы в нем не приняли участие коллективы с разной, взаимодополняющей экспертизой. Необходимо также особо отметить роль Российского научного фонда, поддержка которого по гранту 14–14–0747 составила основу финансирования проекта, а также Российского фонда фундаментальных исследований, поддержавшего работы по квантовой термометрии.

— Какие дальнейшие планы и перспективы у этой темы?

— Ведутся работы по смене ионной селективности TRPA1, чтобы каналы лучше пропускали одновалентные катионы натрия и калия и хуже — двухвалентный кальций. Это повысит избирательность стимуляции. Если же удастся заставить канал проводить анионы хлора, то с помощью этих каналов можно будет подавлять активность нейронов.

В настоящее время мы также работаем над термогенетической активацией сердечной мышцы, встраивая змеиные TRPA1 в кардиомиоциты. Кроме того, данные каналы позволят управлять динамикой ионов кальция в самых разных типах клеток. Все это, во-первых, создаст обширную методическую базу для применения термогенетики в нейробиологии и других фундаментальных областях науки, а во-вторых, создаст задел для новых терапевтических подходов. Инструменты оптогенетики уже используются в ряде клинических испытаний для восстановления функций утраченных нейронов. Преимущество термогенетики в том, что она применима не только для управления нейронами, но и для стимуляции кальций-зависимых процессов в других типах клеток.