Исследование какого-либо организма — процесс сложный и требующий точности. Современные методы сканирования преуспели в этом. Сегодня мы можем достаточно детально изучить организм или отдельный орган на трехмерных изображениях. Лет 100 назад трехмерный вид органов можно было получить только вынув их из организма и рассмотрев в живую, так сказать. Однако всегда есть какое-то «но».

Но даже самые точные сканеры и микроскопы не могут дать 100% точности. Вот если бы можно было сделать все ненужное невидимым, а ту часть организма, которую мы хотим изучить, оставить видимой. Звучит, как научная фантастика, не правда ли? Согласен. Но теперь это реально. Сегодня мы с вами будем знакомиться с исследованием нового метода сканирования организмов на примере дрозофилы. Как ученым удалось сделать обычную фруктовую мошку «невидимой», насколько точен их метод сканирования и как это поможет в диагностике заболеваний человека? Ответы на эти и другие вопросы мы можем получить только в докладе исследователей.

Основа исследования

Дрозофила, — это маленькое и, по правде говоря, надоедливое насекомое является объектом множества исследований. С ее помощью ученые изучают довольно много вещей: от аэродинамики до нервной системы. И именно о последнем пойдет речь сегодня. Изучение столь сложных систем в столь малых организмах сопряжено с определенными сложностями. Нам уже знакомы методы изучения организмов путем их разрезания на множество ультратонких слоев. Такой метод дает возможность изучить многие системы более детально. Однако касательно нервной системы сей метод, по словам исследователей, нарушает клеточную целостность, что усложняет процесс исследования отдельных участков системы.

Если применять сканирование на малых организмах без физического «слоирования», мы будем видеть все системы одновременно. Но ученые хотят исследовать только одну систему, при этом другие не должны мешать этому процессу. Потому им пришла гениальная и простая идея — сделать все невидимым (точнее прозрачным), а нужную систему оставить нетронутой.

На данный момент инструментов для реализации подобной идеи достаточно, остается лишь объединить их вместе. Основными ингредиентами нового метода сканирования под названием FlyClear (в честь первого испытуемого — мухи дрозофилы) являются «очистка» тканей и ультрамикроскопия.

Дрозофила была выбрана в качестве испытуемого не просто так. Основой большинства методов очистки тканей является генетическая модификация испытуемого организма. В данном случае это флуоресценция. Этот процесс крайне сложен и требует много времени. Чем организм больше, тем больше времени уйдет на его модификацию. К тому же, далеко не все существа можно модифицировать так, как этого хотят ученые. Дрозофила же поддается подобным генетическим манипуляциям довольно легко, а процесс этот занимает не так много времени.

На данный момент самым популярным методом исследования организмов является конфокальная микроскопия, но производится она только после рассечения тканей. Возникает вопрос — а если не проводить рассечение? В таком случае мы получим низкокачественное бледное изображение, а сам процесс займет уйму времени. Также будет наблюдаться сильное поглощение и рассеяние фотонов в образце, особенно с повышенной пигментацией тканей (как у дрозофилы). Соответственно, образец необходимо очистить, то есть сделать прозрачным. Тем самым нивелировать снижение интенсивности сигнала и достичь равномерности пространственного разрешения. Основным способом «опрозрачивания» (простите за выдуманное слово) тканей является снижение показателя преломления на границах между клеточными компонентами.

Исследователи не отрицают, что сейчас существует несколько способов, ставших уже классическими, сделать ткани прозрачными. Однако, они также заявляют о наличии у этих способов ряда недостатков. Сохранение морфологии, стабильность флюоресценции, глубина сканирования и прочее — со всеми этими аспектами у существующих методик, мягко говоря, не лады. К тому же, ни одна из них не дает полной депигментации тканей.

Выходит для лучшего сканирования малых тел все же необходимо проводить поперечное сечение тканей? Не совсем. Ученые приводят в пример все ту же дрозофилу. Расположенные в ее периферических регионах (лапки, глаза, усики), сенсорные нейроны дрозофилы обладают очень длинными соединениями с многочисленными нервами и с мозгом. Если эти регионы подвергнуть слоированию, то мы не получим полной картины того, как устроена нервная система в этих регионах.

В данном исследовании метод FlyClear позволил убрать пигментацию тканей дрозофилы, оголив ее нервную систему. На это потребовалось около месяца. А ультрамикроскопия позволила визуализировать самые мелкие нейронные соединения и построить полную карту нервной системы мошки. Также большую роль сыграло вещество, с помощью которого получилось «окрасить» нервную систему в ярко-зеленый цвет — зеленый флуоресцентный белок (далее ЗФБ). Ген данного белка, полученного из медузы Aequorea victoria, используется именно для генной модификации испытуемых образцов.

Медуза Aequorea victoria.

Данные, полученные посредством флуоресцентной микроскопии, обрабатывались специальным алгоритмом, позволяющим создавать трехмерное изображение с высоким разрешением.

Подготовка к исследованию

Оптическая очистка тканей дрозофилы — непростой процесс. Хитиновый экзоскелет и фотопигменты фасеточных глаз являются самыми сложными регионами тела мошки для проведения процедуры. Имеющиеся на данный момент методы тканевой очистки далеки от идеала, потому исследователи создали свой — FlyClear, о нем я упоминал ранее.

FlyClear совмещает в себе сразу несколько предшествующих методов. Первым из них в процессе является CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails). Дальнейшие шаги зависят от состояния образца (личинка или взрослая особь).

Варианты процедуры FlyClear.

В случае личинки используется 0.03% протеаза и формальдегидная фиксация. Дело в том, что протеаза расщепляет пептидные связи между аминокислотами белков, а это помогает «обесцветить» ткани. Далее на образце применяют ацетон для проведения пермеабилизации (изменения проницаемости оболочки клетки).

Ученым удалось усовершенствовать этап CUBIC, заменив [CH₃CH(OH)CH₂]₂NCH₂CH₂N[CH₂CH(OH)CH₃]₂(N, N, N^l, N^l-тетракис (2-гидроксипропил) этилендиамин) на C₁₀H₂₄N₂O₄(2,2^l, 2^ll, 2^lll — (этилендинитрило) -тетраэтанол)). Это изменение позволило достичь полной депигментации тканей, в том числе и в сложных участках (глаза и эпидермис).

Итак, метод полной депигментации тканей работает. Теперь необходимо проверить второй важный этап исследования — флюоресценцию. Точнее необходимо проверить будет ли новый реагент C₁₀H₂₄N₂O₄ подавлять сигналы флуоресценции, учитывая что дрозофилы и так обладают низкой флуоресценцией после генетических манипуляций. Для теста образцы (тела дрозофил) были разделены пополам: одна половина была без обработки, вторая — с обработкой. Анализ показал, что уровень выраженности ЗФБ и правда снижается при использовании C₁₀H₂₄N₂O₄, однако на общую точность это не влияет. А все благодаря тому, что этот же реагент позволил достичь высокой степени депигментации тканей. То есть, плюсы реагента нивелировали его недостатки.

Готовый образец необходимо, так сказать, рассмотреть, а для этого использовалась усовершенствованная ультрамикроскопия, позволяющая получить изображение образца с одинаковым разрешением во всех плоскостях.

Оптическая система: 1 и 3 — плоско-выпуклая асферическая цилиндрическая линза; 2 — линза Пауэлла; 4 — эллиптическая аподизирующая мягкая апертура; 5 и 6 — ацилиндрические линзы..[image]

Как правило, в стандартной ультрамикроскопии используют цилиндрические линзы и прямоугольную апертуру. В данном же исследовании были использованы дополнительные составляющие, которые изменяют форму луча на ультратонкий с улучшенными характеристиками. Использование сферических линз обусловлено возможностью получить изображение без искажений и с минимальной аберрацией. Стандартная апертура также была изменена на эллиптическую аподизирующую мягкую апертуру (на изображении выше под номером 4). Новая апертура позволила элиминировать нежелательное распределение интенсивности в оптической системе.

Результаты исследования

Ученые без стеснения называют самым большим достижением своего исследования возможность создавать полноценную трехмерную карту нервной системы. А если учесть, что эта система принадлежит столь малому организму (дрозофиле), то такое достижение становится еще более значимым.

Новая методика позволяет точно определить, где и как соединяются те или иные нейроны, как между собой, так и с мозгом. Если бы использовалось поперечное сечение, такого бы достичь не удалось.

В качестве демонстрации возможностей своего метода ученые показывают нам два типа нейронов зрительной системы дрозофилы: DCN — дорсальные кластерные нейроны и MCN — мозговые столбчатые нейроны (колонки кортекса в заднем отделе мозга). В дорсо-латеральной области мозга DCN кластеры образуют комиссуральные соединения для возбуждения синаптических нейронов медуллы и лобулы в оптической доле. (изображения выше а, с).

На изображениях b и d видна потеря комиссурального соединения у гомозиготных мутантов нейронных клеток Neuroglian. Эти изменения нервной системы связаны именно с процессом клеточной очистки FlyClear.

Для построения трехмерной реконструкции были сделаны снимки с двух ортогональных направлений, которые после были объединены. Алгоритм на базе 3D FFT определяет детали образца, которые выглядят более четка в одном из двух стеков снимков. Далее все это объединялось воедино в одну трехмерную реконструкцию.

Желающие более детально ознакомится с исследованием могут почитать доклад ученых.

Эпилог

Ученые не зря хвастаются и гордятся своим трудом, ибо подобного ранее не было. Метод слоирования путем поперечного сечения был доминирующим в сфере исследований организмов. Но такой метод, хоть и имеющий много преимуществ, обладает огромными недостатками. В частности, разрезы нарушают клеточную и тканевую целостность, тем самым усложняя процесс реконструкции той или иной системы организма.

Исследовать организм со сложной нервной системой, когда важна каждая деталь, теперь будет значительно проще. Ученые смогут получить больше данных, что позволит им более детально описать те или иные процессы в организме.

Также не стоит забывать, что дрозофилы это лишь подопытные в данном исследовании, а не его основа. Совершенствование нового метода сканирования может послужить и человеку. И не только для изучения тела и его составных элементов, но и для диагностики заболеваний, которые на ранних этапах могут прятаться там, где имеющиеся на данный момент методы сканирования не могут их определить.

Исследования открывают много нового: новые виды животных, новые вещества, процессы и явления. Но без исследований, направленных на создание инструментов исследований, все это было бы невозможно.

Автор: Dmytro_Kikot