В статье, опубликованной на этой неделе в журнале Journal of the American Chemical Society, ученые из Университета Калифорнии – Санта-Круз (UCSC) сообщают о достигнутом ими прогрессе в секвенировании ДНК – непрерывном и контролируемом перемещении полимера одноцепочечной ДНК (ssDNA) через белковую нанопору с помощью фермента ДНК-полимеразы. Исследователи из UCSC тесно сотрудничают со своими коллегами из Oxford Nanopore Technologies, Великобритания, – разработчиками технологии секвенирования ДНК с помощью нанопор.

(nanoporetech.com)

Новое исследование является продолжением предыдущей работы, показавшей, что ДНК можно перемещать через нанопору с помощью фермента полимеразы. Движение ДНК по нанопоре в более ранних экспериментах осуществлялось серией полимераз и требовало сложной электроники для управления процессом. Усовершенствования, описанные в статье в JACS, включают в себя технологию, позволяющую осуществлять постоянное перемещение одноцепочечной ДНК, дающее непрерывный сигнал о прохождении цепочкой нанопоры в режиме реального времени. Комплекс фермент-нанопора был активен и измеряем в постоянном электрическом поле без сложной электроники.

Контролируемое начало процессинга ДНК полимеразой у комплекса нанопора-фермент позволяло проводить последовательное измерение нескольких молекул одноцепочечной ДНК с помощью одной экспериментальной установки. Кроме того, полимераза демонстрировала хорошее связывание с полимером ДНК в отличие от ранее используемых ферментов, исследованных в аналогичных условиях. Эти результаты подтверждают, что свойства ДНК-полимеразы бактериофага phi29 могут быть использованы в технологии цепочечного секвенирования.

Метод «цепочечного секвенирования» ДНК с помощью нанопор основан на оценке ионных токов, проходящих через белковую нанопору. Для последовательной идентификации нуклеотидов одноцепочечной полимерной молекулы ДНК используются характерные для каждого основания изменения ионного тока. Две основные проблемы этого метода: разработка нанопоры, которая позволяет идентифицировать отдельные основания одноцепочечного ДНК-полимера в момент его нахождения в поре; механизм управления перемещением ssDNA с постоянной и соответствующей скоростью, позволяющий идентифицировать основания с помощью электронных измерений. Описанные в данной статье методы транслокации ssDNA полностью совместимы с технологией идентификации нуклеотидов, разработанной в лабораториях Oxford Nanopore Technologies и их коллег.

«Работа с ДНК-полимеразой бактериофага phi29 позволила нам достичь значительного прогресса в ключевом элементе цепочечного секвенирования ДНК», – говорит профессор Марк Эйксон (Mark Akeson) из UCSC. «В то время как предыдущая работа показала, что контроль над транслокацией возможен теоретически, это исследование продемонстрировало, что управление транслокацией ДНК достижимо в условиях, совместимых с электронной технологией секвенирования. Мы надеемся на дальнейшее сотрудничество с Oxford Nanopore для практической реализации нашей работы».

Одноцепочечная ДНК (ssDNA) транслоцируется через нанопору (белок альфа-гемолизин) с помощью фермента ДНК-полимеразы бактериофага phi29 (phi29DNAP). Этот фермент был выбран благодаря его хорошей процессивности и высокой аффинности (сродству) к ДНК-субстрату. Комплекс нанопора-фермент стабилен в электрическом поле при напряжении в 180 mV – уровне, совместимом с одновременной идентификацией оснований ДНК с помощью нанопоры. В присутствии молекул дезоксинуклеозидтрифосфата процессинг ssDNA может начаться непосредственно у нанопоры с добавлением нуклеотидов в режиме реального времени, приводя к перемещению ssDNA через пору. Нанопора, используемая в данном исследовании, не была разработана для распознавания нуклеотидов, и поэтому для наблюдения за его проходом через пору в одноцепочечную ДНК был введен abasic участок (участок с удаленными азотистыми основаниями). (Image:pubs.acs.org)

«Метод «цепочечного секвенирования» ДНК, использующий нанопоры, изучается уже много лет, но эта статья впервые показывает, что ДНК можно транслоцировать через пору с помощью фермента, используя методы, согласующиеся с электронной технологией с высокой пропускной способностью», – говорит доктор Гордон Сангера (Gordon Sanghera), генеральный директор Oxford Nanopore. «Мы в восторге от этой работы и от ее возможностей в сочетании с недавними разработками в области идентификации оснований ДНК на ДНК-цепочке – в другом важнейшем элементе цепочечного секвенирования»

Аннотация к статье: Processive Replication of Single DNA Molecules in a Nanopore Catalyzed by phi29 DNA Polymerase