Группа ученых под руководством специалистов из Массачусетской общей больницы (Massachusetts General Hospital – MGH) разработала способ быстрого получения адресных синтетических ферментов, позволяющих инактивировать, восстанавливать или изменять определенные последовательности ДНК. Статья об этом успехе, опубликованная он-лайн в Nature Methods группой молекулярной патологии MGH, описывает высокоэффективный и менее трудоемкий способ сборки мощного инструмента – цинксодержащих белков-нуклеаз, называемых «цинковыми пальцами» (zinc-finger nucleases, ZFNs).

«Применяя наш подход, названный контекстно-зависимой сборкой, любой ученый может использовать либо стандартные методы молекулярной биологии, либо коммерческий синтез ДНК для создания ZFNs для нужных генов-мишеней», – говорит доктор медицины и философии Кит Дж. Чжун (J. Keith Joung), старший автор статьи. «ZFNs  – широко используемый, мощный инструмент манипуляций геномом клеток различных организмов, включая человека. Они могут обеспечить эффективную корректировку генных мутаций, ответственных за здоровье человека, позволяя избежать проблем, возникающих в связи с неточностью сегодняшних генно-терапевтических подходов, использующих вирусные векторы».

Кит Дж. Чжун (J. Keith Joung), MD, PhD.
(Фото: jounglab.org)

Большинство человеческих факторов транскрипции, регулирующих трансляцию генетического сигнала в белок, взаимодействуют с определенными последовательностями ДНК, используя пептиды, называемые «цинковыми пальцами». Нуклеазы «цинковые пальцы» – синтетические, «дизайнерские» белки, состоящие из белкового Zn-домена, разработанного для связывания с определенной ДНК-последовательностью, и фермента, расщепляющего обе цепочки ДНК по месту сайта-мишени. Несмотря на огромный потенциал ZFNs, создание требуемых белков до сих пор оставалось сложной задачей.

При самом простом подходе, известном как модульная сборка, отдельные пептиды соединяются друг с другом, как бусины на нитке, создавая многопальцевый белок, теоретически способный распознавать длинные отрезки ДНК. Чжун и другие показали, что на практике модульная сборка многопальцевых белков не приносит успеха. Большинство неудач, вероятно, связано с «контекстно-зависимыми» эффектами, которые отдельные цинковые пальцы могут оказывать на активность связывания с ДНК соседних пальцев. Сборку пептидов, неспособных адекватно работать вместе, можно сравнить с попытками собрать головоломку из не вписывающихся в нее частей.

В 2008 году Чжун и его коллеги из Университета Миннесоты (University of Minnesota), члены Zinc Finger Consortium, сообщили о разработке метода, названного OPEN (Oligomerized Pool Engineering), который принимает в расчет такие контекстно-зависимые эффекты. Но, несмотря на то, что OPEN дает хорошие результаты, он очень трудоемок и требует чрезвычайно много времени – до года, чтобы лаборатория смогла установить технологию, и два месяца для получения нужных ZFNs. Для решения этих проблем ученые из MGH собрали обширный архив цинковых пальцев, о которых известно, что они хорошо работают, находясь рядом друг с другом – по существу, уже собранных частей головоломки. Используя этот контекстно-зависимый метод, они смогли собрать десятки ZFNs всего за четыре дня.

«Имея такой архив, любой ученый может легко получить собственные ZFNs менее чем за неделю, и для этого ему не нужно никаких специальных знаний», – объясняет Чжун. «С помощью контекстно-зависимой сборки можно создавать большое количество ZFNs одновременно, что сложно сделать методом OPEN, так как он более трудоемок».

Как и в случае с OPEN, лаборатория Чжун и Zinc Finger Consortium сделает программное обеспечение и реагенты, необходимые для практического применения контекстно-зависимой сборки, доступными для всех академических лабораторий.

Один из примеров работы цинко-пальцевых нуклеаз (ZFNs). ZFNs – инструмент индукции разрыва двойной цепочки ДНК. ZFNs – химерные гены, состоящие из синтетического ДНК-распознающего домена из трех С2Н2 цинковых пальцев, связанного с неспецифическим ферментом рестрикции (как правило, эндонуклеазой FokI), расщепляющим ДНК (А). ZFN-гены, в которых каждый палец распознает трехнуклеотидную последовательность, потенциально могут быть разработаны для узнавания любой комбинации из девяти нуклеотидов, например, такой как представлена на рисунке (В). Так как FokI функционирует как димер, для связывания с ДНК-мишенью используются два набора ZFNs с уникальной комбинацией из 18 нуклеотидов. После связывания с ДНК клетки (С) домен эндонуклеазы FokI расщепляет ДНК и создает двойной разрыв (D), что во многих случаях ведет к делеции (удалению) мутации и последующему восстановлению сайта.
(Рисунок: mcdb.lsa.umich.edu)

«Одним из Святых Граалей генетики является возможность модифицировать отдельные гены-мишени», – говорит Лори Томпкинс (Laurie Tompkins), курирующий гранты в области генетики Национального института общих медицинских наук (National Institute of General Medical Sciences), одного из институтов Национального института здравоохранения (National Institutes of Health) США, горячий сторонник исследования Чжуна. «Доктор Чжун и его коллеги разработали чрезвычайно простую и эффективную стратегию использования технологии цинковых пальцев для замены измененных вариантов генов на нормальные, или наоборот, обеспечив как ученых, так и клиницистов исследовательским инструментом с широким спектром возможностей».

«Я считаю, что на данный момент контекстно-зависимая сборка окажет наибольшее влияние на исследования, использующие ZFNs для генетического манипулирования модельными организмами, возможно, даже моделями, полученными из плюрипотентных стволовых клеток. Большое влияние она окажет и на возможность создавать нокаутирующие мутации в больших сериях генов, принимающих участие в развитии или связанных с определенными заболеваниями. ZFNs можно использовать и для создания полных коллекций мутантов для каждого гена любого организма», – добавляет Чжун.

Доктор Чжун является также доцентом кафедры патологии Гарвардской медицинской школы (Harvard Medical School) и членом Центра вычислительной и интегративной биологии (Computational and Integrative Biology) и Центра изучения рака (Center for Cancer Research) Массачусетской общей больницы.

Аннотация к статье: Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly (CoDA)