Международный коллектив исследователей решил использовать для погружения в клетку в качестве наконечника нанопипетки – углеродные нанотрубки (УНТ). Для нанесения УНТ (внешний диаметр варьировался от 50 до 200 нм, а длина нанотрубок составляла десятки нанометров) авторы статьи использовали специально разработанную ими технологию. По утверждениям авторов статьи, предложенная ими технология позволяет получать наконечники не только из нанотрубок, но и из других наноразмерных объектов.

Биохимики всегда стремились найти наиболее доступный и «мягкий» способ проникать вглубь клеток. В частности, к настоящему времени разработаны и опробованы на практике стеклянные пипетки с толщиной наконечника до 25 нм. Однако проникновение такой пипетки вглубь клетки на расстояния более 1 мкм зачастую приводит к ее серьезному повреждению. Серьезного улучшения не удалось достичь, даже после получения углеродных нанопипеток (где в качестве шаблона вновь выступала стеклянная пипетка) c толщиной наконечника до 10 нм. Считается, что это может быть связано с конической формой наконечника. Поэтому международный коллектив исследователей решил использовать в качестве наконечника нанопипетки углеродные нанотрубки (УНТ). Для нанесения УНТ (внешний диаметр варьировался от 50 до 200 нм, а длина нанотрубок составляла десятки нанометров) авторы статьи использовали специально разработанную ими технологию (рис.1). По утверждениям авторов статьи, предложенная ими технология позволяет получать наконечники не только из нанотрубок, но и из других наноразмерных объектов.

Рис. 1. i. Стеклянная пипетка, наполненная суспензией УНТ, приводится в контакт со стеклянной подложкой. ii. Удаляя стеклянную пипетку от подложки, благодаря силам поверхностного натяжения из суспензии вытягивается УНТ. iii. Вытянутая УНТ приклеивается к стеклянной пипетке эпоксидной смолой.

Изменение концентрации ионов кальция в цитозоле служит индикатором механического повреждения клетки: концентрация кальция регулируется посредством механочувствительных каналов (мембранные белки), непосредственно связанных с микрофиламентами, в ответ на введение постороннего предмета внутрь клетки. Это было доказано путем введения ионов гадолиния (III), которые блокировали механочувствительные каналы, и тем самым препятствовали изменению концентрации ионов кальция в цитозоле. Чрезмерное увеличение концентрации ионов кальция в цитозоле может привести к цитотоксическому воздействию, и как следствие, к гибели клетки. При введении обычного эндоскопа с коническим наконечником вглубь клетки изменение концентрации ионов кальция может быть весьма существенным, в то же время, введение эндоскопа с наконечником из УНТ вызывает лишь незначительное и кратковременное изменение концентрации Ca2+.

Рис. 2. Микрофотографии, полученные методом интерференционной микроскопии до (а) и после введения обычной стеклянной пипетки (b) и соответствующие фотографии, полученные методом люминесцентной микроскопии (c,d). Микрофотографии, полученные методом интерференционной микроскопии до (e) и после введения стеклянной пипетки c наконечником из УНТ, диаметром 100 нм (f), и соответствующие фотографии, полученные методом люминесцентной микроскопии (g,h).

Для более наглядного подтверждения авторы статьи исследовали HeLa клетки, в которых вырабатывается люминесцирующий белок EYFP-β-актин, благодаря которому возможна простая визуализация микрофиламентов – составной части цитоскелета (рис.2). На микрофотографиях отчетливо видно, что наконечник эндоскопа, проникая внутрь клетки, приводит лишь к локальным повреждениям цитоскелета, либо же вообще оставляет цитоскелет неизменным. Однако практический интерес биохимиков не ограничивается лишь проникновением сквозь клеточную мембрану, но также сфокусирован на возможности исследования отдельных клеточных органелл, в частности митохондрий. Для этого исследователи обработали участок митохондрии, в который вводится зонд, обрабатывался потенциал-чувствительным красителем MitoTracker Orange, а также сравнивали энергетическое состояние органеллы до и после введения зонда (рис.3). Синхронное изменение потенциала митохондриальной мембраны и концентрации ионов кальция в цитозоле свидетельствует о сохранении функциональной активности органеллы.

Рис. 3. а) Изображение митохондрии, с нанесенным красителем. b) Увеличенная область около наконечника эндоскопа. с) Спектры, соответствующие одновременному измерению концентрации ионов кальция в цитозоле и потенциала митохондриальной мембраны.