Впервые исследователям удалось наблюдать за взаимодействием молекул белка с длинноцепочечной молекулой ДНК в режиме реального времени. Предполагается, что результаты нового исследования позволят получить новую информацию об особенностях репликации и репарации ДНК.

Разработавший новый метод наблюдения за биомолекулами Эрик Грин из Университета Колумбия отмечает, что до настоящего времени было возможно наблюдение лишь за взаимодействием белков с весьма небольшими по размерам одноцепочечными участками ДНК или двухцепочечными молекулами, однако в клетке в обменных процессах, в которых принимает участие ДНК, например – репарации, принимает участие лишь одна цепь ДНК.

Рис. 1. Рисунок из Anal. Chem., DOI: 10.1021/ac302117z.

Для разработки способа слежения за длинными одноцепочечными молекулами ДНК исследователи из группы Грина модифицировали разработанный ими ранее метод, позволяющий визуализировать взаимодействие белков с двухцепочечной ДНК. Этот метод заключался в том, что молекулу ДНК с введенной флуоресцентной меткой связывали с липидами, находящимися в двойном слое, который прикрывал поверхность микрокапиллярной камеры с образцом. При пропускании буферного раствора через камеру молекулы ДНК диффундируют через двойной слой, ориентируясь вдоль наноразмерного барьера в двойном слое.

Исследователи добавляли белки к камере и наблюдали их взаимодействие с ДНК в режиме реального времени, следя за изменением флуоресцентного сигнала. Исследователи назвали новый метод «ДНК-занавесь», поскольку сотни регулярно ориентированных ДНК, визуализированных с помощью флуоресцентной микроскопии, напомнил им занавеску для окон.

Однако эта методика шестилетний давности не позволяла работать с одноцепочечной ДНК, которая настолько гибка, что часто самоскручивается, образуя вторичные структуры, пне способные связываться с белками, к тому же флуоресцентные красители, применяющиеся для введения метки в двухцепочечные ДНК, могут способствовать разрушению одноцепочечных ДНК.

Решая эту проблему, Грин с соавторами нашли способ одновременной раскрутки свернутой одноцепочечной ДНК и введения в нее флуоресцентной метки. Ключом для решения проблемы оказался репликативный белок А (RPA), который связывается с одноцепочечными нитями ДНК в ходе репликации ДНК, не позволяя ДНК скручиваться. Когда исследователи добавили белок со введенной флуоресцентной меткой к системе «ДНК-занавесь», белок связывался с одноцепочечными ДНК, что способствовало растяжению ДНК и обеспечивало доступность ДНК для белков. Поскольку белок RPA в клетках связывается со всеми одноцепочечными ДНК, то, что этот белок помешает связыванию с ДНК других белков, маловероятно.

Для проверки того, сможет ли модифицированная система визуализировать взаимодействия одноцепочечной ДНК с другими белками, исследователи ввели флуоресцентно меченный белок Sgs1 в проточную ячейку, содержащую ДНК, связанную с RPA. Белок Sgs1 представляет собой геликазу дрожжей, участвующую в процессе репарации ДНК (восстановления одной из поврежденных цепей ДНК по информации с другой – комплементарной цепи).

С помощью флуоресцентной микроскопии, позволяющей наблюдать и за белком RPA и Sgs1, исследователи смогли наблюдать связывания белка Sgs1 с одноцепочечной ДНК в режиме реального времени.