Для того чтобы научиться «писать» бактериями, специалисты из Корейского национального института транспорта (Южная Корея) адаптировали технику, позволяющую писать протеинами, полимерами и другими наноразмерными молекулами.

Перьевая нанолитография использует иглу («перо») атомно-силового микроскопа (АСМ) для нанесения молекул («чернил») в определённые точки на поверхности субстрата. Вначале игла микроскопа погружается в раствор, содержащий желаемые молекулы. Затем при сближении иглы и субстрата возникает водный мениск шириной менее 1 мкм, через который молекулы, содержащиеся в растворе, диффундируют на поверхность субстрата.

Технология широко используется для создания рисунков (не художественных, конечно) молекулами ДНК, небольшими полимерами и другими молекулами, длина которых не превышает 100 нм. Но вот микронные бактерии явно не вписываются в размеры водяного мениска, что критически важно для перьевой нанолитографии.

Рис. 1. Флюоресцирующие зелёным точки нарисованы чернилами, содержащими светящиеся бактерии. (Микрофото ACS).

Кому нужно это «бактериологическое письмо»? Как ни странно, всем.

Адаптация перьевой литографии к бактериальному применению позволила бы учёным легко создавать высококачественные биосенсоры и иные биоустройства, основанные на точнейшем позиционировании рабочих микробов.

Но стандартная игла АСМ и водные растворы, увы, не позволяют использовать этот простой метод в случае бактерий. Потому корейские учёные пошли путём Александра Македонского и вместо бесплодных попыток развязывания гордиева узла отбросили всё старое и разработали новую иглу и жидкость, которые позволили бы удерживать микроорганизмы.

Подробнее о предпосылках и результатах работы читайте в Journal of the American Chemical Society.

В первую очередь исследователи покрыли АСМ-иглу слоем поли(2-метил-2-оксазолина) — полимером, способным образовывать гидрогели. Гидрогель в данном случае выступает в роли губки, расширяющейся при втягивании в себя больших частиц, таких как вирусы и бактерии. Именно этот гель и был использован вместо узенького водного мениска для установления диффузионного контакта с субстратом. К тому же в силу высокой гидрофильности гель отталкивает биомолекулы, способствуя транспорту вирусов и бактерий на поверхность субстрата.

Кроме того, нужно было найти способ, позволяющий избежать высыхания и смерти бактерий во время «письма». Для этого пришлось разработать специальные «чернила», переносящие и сохраняющие живые бактерии.

Учёные применили смесь глицерина, имеющего высокую температуру кипения (для предотвращения испарения), и водный раствор трицина — аминокислоты, ускоряющей перенос бактерий на подложку. Контроль количества переносимых бактерий осуществляется простым варьированием соотношения глицерин — трицин. Дело в том, что это соотношение определяет вязкость «чернил», а более вязкие чернила, как было экспериментально установлено, удерживают больше бактериальных клеток на игле и тем самым способствуют переносу большего их числа в каждую точку поверхности.

Для демонстрации работоспособности созданной системы авторы применили два сорта чернил — с 10 и 20% глицерина. Оба смешивались с флюоресцентными бактериями E. coli. Бактерии маркировались сразу двумя типами лейблов — зелёным красителем, светящимся только в том случае, если стенки бактериальных клеток не повреждены, и красным, флюоресцирующим при разрыве клеточных мембран и смерти клеток.

Использование чернил с повышенным содержанием глицерина привело к формированию 13-микрометровых пятен на поверхности функционализированного аминами силикагеля. Причём каждое пятно содержало от 7 до 8 бактериальных клеток. Клетки светились зелёным и были совершенно «здоровы». При применении чернил с 10-процентным содержанием глицерина наблюдалось образование значительно меньших флюоресцирующих зелёным пятен, включающих одиночные бактериальные клетки..[em]