Как «ножницы» возвращают зрение, найден ли генетический Грааль и как склеить ДНК.

Свести концы с концами, чтобы победить слепоту

«Святой Грааль» геномного редактирования — так назвали эту технологию в релизе Института Солка в Калифорнии. Впервые ученые успешно отредактировали геном не делящихся, а полностью сформированных клеток взрослого организма и помогли слепым крысам прозреть.

Статья об этом выдающемся исследовании, которое было выполнено в Университете Солка в сотрудничестве с учеными из других институтов США, Саудовской Аравии, Японии, Китая и Испании, вышла в Nature.

Снимок мозга взрослой мыши. Зеленым отмечены нейроны с отредактированным геномом. Salk Institute

Генетические ножницы с точным прицелом

Технологию CRISPR/Cas9 часто называют «умными генетическими ножницами», так как она позволяет достаточно точно находить и разрезать ненужный клетке ген. В естественных условиях эта система служит «иммунитетом» бактериям, которые собирают базу «отпечатков пальцев» нападавших на них вирусов, чтобы при новом вторжении распознать и нейтрализовать врага. Однако CRISPR/Cas9 у эукариотов лучше будет работать в делящихся клетках, ведь именно в них при разрушении мутировавшего гена включается особый механизм починки (репарации) двухцепочечных разрывов ДНК, который «залатает» пробел, ориентируясь на вторую, «правильную», копию гена из парной (гомологичной) хромосомы. В ходе этого процесса разорванная двухцепочечная нить сближается с другой нитью ДНК, содержащей копию этого участка. «Нить-образец» расплетается, и поврежденная копия синтезирует на ее основе одну из цепей, а уже по ней достраивает вторую. Это называется гомологичной репарацией (HR), и происходит она во время деления клетки.

Однако во взрослом организме большинство клеток уже сформировалось и делится редко. Если нужно отредактировать мутацию именно в них (например, вылечить взрослого человека от слепоты или от заболевания нервной системы, которое не было выявлено на уровне эмбриона), возникают трудности. И вот международная группа генетиков наконец нашла способ разрешения этой проблемы.

Как склеить ДНК без шпаргалок и гомологичной репарации

Разработанная учеными технология называется HITI (homology-independent targeted integration — «независимое от гомологии адресное присоединение»). Она использует не систему гомологичной репарации, а процесс, называемый «негомологичное соединение концов» (название на английском — non-homologous end joining, или NHEJ — было придумано Муром и Хабером в 1996 году).

Концы разъединенной ДНК в этом случае сшиваются ферментом лигазой напрямую, без «консультации» с гомологичной хромосомой. При участии и помощи множества других белков лигаза находит короткие (микрогомологичные) кусочки разрыва и с ювелирной точностью их склеивает.

«Мы в восторге от открытой нами технологии, потому что ранее сделать это не получалось, — признается Хуан Карлос Изписуа Бельмонте, профессор в Лаборатории генной экспрессии в Институте Солка и соавтор статьи. — Впервые мы можем вторгнуться в клетку, которая не делится, и модифицировать ДНК по собственному желанию. Возможности применения этого открытия очень широки».

Первым применением технологии, сочетающей в себе систему CRISPR/Cas9 и репарацию по пути NHEJ, стало возвращение зрения грызунам, но в дальнейшем ее можно применять для лечения широкого спектра генетических заболеваний органов зрения, нервной и сердечно-сосудистой систем.

Вирусы с лечебным «грузом» помогли крысам прозреть

Опираясь на новую комбинированную технологию, биологи создали набор генетических инструкций для клетки, смесь которых назвали HITI, и нагрузили им искусственно обезвреженный вирус, который доставил их в нейроны, выращенные из эмбриональных стволовых клеток человека. Для начала им ничего не исправляли, а просто присоединяли к генетическому грузу вирусов коды флуоресцентных белков, чтобы эффективность адресного встраивания и функционирования в клетках этих генов можно было пронаблюдать визуально. Это стало первым доказательством работы технологии в неделящихся клетках.

Затем конструкцию успешно удалось доставить в мозг взрослой мыши. На завершающей стадии ученые наконец добрались до редактуры генома живого взрослого организма. Подопытными животными стали крысы с пигментным ретинитом — генетическим заболеванием, при котором происходит деградация колбочек и палочек, фоторецепторов сетчатки.

Трехнедельным крысам ввели вирусы, которые «везли» в своем геноме функциональную копию гена Mertk, нарушение функции которого является одной из причин пигментного ретинита. К возрасту восьми недель крысы реагировали на свет, были способны обходить препятствия и проходить тесты, где требуется применять зрение.

Авторы работы подчеркивают, что их технология подарила возможности, о которых раньше не приходилось даже мечтать. Человечество стоит на пороге прижизненного исправления вредных мутаций в клетках печени, сердца и мозга — неудивительно, что в этой технологии увидели настоящий генетический Грааль, обещающий исцеление и долголетие.