Ученые из МГУ совместно с коллегами предложили новый метод определения уровня НАД+, соединения — индикатора биологического возраста человека и патологий его метаболических процессов. Недорогой набор химических реагентов и простота анализа помогут внедрить содержание НАД+ как параметр в клинической и исследовательской практике.

Результаты работы опубликованы в Analytical Biochemistry. Исследования поддержаны грантом Российского научного фонда.

Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) — важнейшее соединение, используемое для выработки энергии живыми организмами. В обмене веществ оно участвует в окислительно-восстановительных реакциях, то есть забирает электроны у одних молекул (окисляя их) и отдает другим (восстанавливая). Его форма, способная забирать электроны (НАД+), также участвует в работе сигнальных систем клетки, позволяющих ей реагировать на внешние стимулы.

Недавно обнаружены функции этого соединения, связанные с химическими модификациями белков. Изменение количества НАД+ в клетках в течение суток участвует в механизмах поддержания биологических часов — так называемых циркадных ритмов.

Работа биологических часов ухудшается в процессе старения, а ее нарушение ведет к различным заболеваниям. Поэтому уровень НАД+ можно использовать как один из маркеров, с помощью которых определяют биологический возраст организма, а также патологии метаболических процессов, включая развитие ожирения, некоторых болезней сердца, печени, нейродегенеративных заболеваний (например, болезни Альцгеймера и Паркинсона), хронического воспаления и рака.

Соответственно, содержание НАД+ может быть и индикатором эффективности фармакологических воздействий на данные состояния организма. Имея легкодоступные, быстрые и недорогие методики определения количества НАД+ в клетках, можно было бы использовать этот показатель в клинической и исследовательской практике. Однако существующие на сегодняшний день методы требуют не только сложного оборудования, но и высококвалифицированного персонала и дорогих расходных материалов, что ограничивает их применимость для клинических анализов и внедрение в практику.

В качестве альтернативного подхода сотрудники научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского МГУ с коллегами предложили использовать формиатдегидрогеназу (ФДГ) — фермент, который есть у микроорганизмов и растений. Он окисляет самую маленькую из органических кислот, муравьиную, передавая ее электроны на молекулу НАД+ в виде гидрид-иона — отрицательно заряженного иона водорода, содержащего «лишний» электрон. Таким образом НАД+ переходит из окисленной формы в восстановленную (обозначается как НАДН), которая способна флуоресцировать. Благодаря этому количество принявшего электроны НАД+ можно определить с помощью флуоресцентного анализа.

В работе использовали так называемую рекомбинантную формиатдегидрогеназу — дополнительно доработанную с помощью методов белковой инженерии. По сравнению с природным ферментом она обладает более высокой температурной и химической стабильностью, а также не катализирует другие реакции.

Такие свойства дают возможность использования ФДГ для определения НАД+ в сложных образцах биологических жидкостей, содержащих множество различных соединений. Исследователи предлагают создать коммерческий набор реагентов для таких ферментативных измерений НАД+, например, в крови. Анализы можно будет проводить на микропланшетных ридерах — относительно недорогих устройствах, широко используемых для диагностики, биотехнологий, ветеринарии и научных исследований. В аппарат помещают планшет со множеством лунок, что позволяет одновременно анализировать до нескольких сотен образцов.

Ученые считают, что предложенный метод способен значительно упростить и удешевить текущие методики измерения уровня НАД+, и это может помочь внедрению их в клиническую и исследовательскую практику. Они успешно продемонстрировали свой метод для измерения уровня НАД+ в мозге крыс — ткани с высоким содержанием липидов, которые обычно сильно ухудшают эффективность анализа. Ткань мозга обрабатывали смесью метанола и уксусной кислоты, добавляли к экстракту генно-инженерную ФДГ, клонированную из термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha, и зарегистрировали протекание каталитической реакции. В дополнение к анализам экстрактов цельной ткани мозга НАД+ также измерили в экстрактах ее митохондрий.

«Имеющиеся у зарубежных производителей аналоги коммерческих наборов для измерения содержания НАД+ используют ферменты, обладающие рядом существенных недостатков, которые отсутствуют у использованной в нашей работе ФДГ из O. parapolymorpha. Помимо высокой эффективности и специфичности связывания НАД+, этот фермент обладает высокой физической и химической устойчивостью. Поэтому можно использовать одну партию препарата для измерения большого количества различных биологических образцов в течение длительного времени», — рассказала Виктория Буник, доктор химических наук, профессор факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ имени М. В. Ломоносова и Первого МГМУ имени И. М. Сеченова.

Исследования проводились совместно с коллегами из группы генетической инженерии и дизайна белков кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова и лаборатории молекулярной инженерии ФИЦ биотехнологии РАН (руководитель — профессор, доктор химических наук В. И. Тишков).