Биологи разработали систему CRISPRoff, которая способна направленно подавлять активность генов, не внося мутаций в ДНК. Механизм работы этого инструмента основан на эпигенетическом перепрограммировании, которое не зависит от CpG-сайтов метилирования в генах. Подавление активности генов CRISPRoff наследуется, что удалось показать на поколениях стволовых клеток, развивающихся в нейроны. Ученые также создали инструмент, способный восстановить активность генов после CRISPRoff и назвали его CRISPRon.

Исследование опубликовано в журнале Cell.

Система направленного геномного редактирования CRISPR/Cas9 — один из самых востребованных инструментов в биологических исследованиях. Такая система позволяет вносить разрывы в определенное место в геноме при помощи белка Сas9 в комплексе с направляющей РНК, что чаще всего используют в двух целях: «выключение» разорванного гена или встройка новой последовательности в разрыв. Получение моделей с неработающими генами позволяет исследовать их функции и изменять свойства организмов в зависимости от задач ученых. За открытие механизмов работы системы CRISPR/Cas в 2020 году присудили Нобелевскую премию исследовательницам Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудне.

Несмотря на универсальность этого метода, его применение ограничено необходимостью вносить разрывы в последовательность ДНК, что часто приводит к мутациям в нецелевых районах генома и неправильному восстановлению ДНК в целевых. Так, например, скандально известный Хэ Цзянкуй, который впервые получил генно-модифицированных детей (а в последствии и тюремный срок), не смог контролировать точность работы CRISPR в своих экспериментах — в геномах близняшек оказались нецелевые мутации.

Биологи из университета Калифорнии создали CRISPR-механизм, который способен «выключать» гены без внесения разрывов и мутаций в ДНК. Он основан на эпигенетическом перепрограммировании — метилировании нуклеотидов (присоединении к ним метильной группы) таким образом, чтобы ген потерял сродство к ферментам транскрипции и перестал работать. Свою разработку биологи назвали CRISPRoff.

Как и в классическом CRISPR-инструменте, одним из компонентов в нем стал белок Cas9, но не обычный, а «мертвый» (deadCas) — то есть способный только связываться с нужным участком ДНК, но не вносить в него разрыв. К нему присоединили другие каталитические домены — метилтрансферразы. Таким образом, химерный белок смог метилировать нуклеотиды ДНК вокруг себя, подавляя активность генов.

При этом уже через 10 дней после добавления белка к клеткам, его уже было невозможно обнаружить, хотя его эффект сохранялся до 15 месяцев исследования.

Специфичность и эффективность работы системы подтвердило секвенирование РНК — у супрессированных генов практически не было транскиптов. Эффект CRISPRoff наблюдался и для генов, в которых не были аннотированы СpG-островки — двухнуклеотидные сайты в ДНК, по которым происходит естественное метилирование в клетке, то есть потенциально его можно использовать для любой последовательности в геноме.

Биологи также подтвердили, что метилирование CRISPRoff можно отменить. Для этого они создали похожий инструмент — CRISPRon. Этот белок также состоял из инактивированного Cas и фермента, но на этот раз им был деметилирующий агент. Чтобы проверить его работу, биологи использовали клетки, в которых уже был метилирован ген CLTA. Уже через десять дней после применения CRISPRon, в клетках восстановился нормальный уровень работы гена (p<0,0001).

Чтобы проверить, как эффект CRISPRoff сохраняется при дифференцировке индуцированных стволовых клеток (ИСК) в другие клеточные типы, биологи обработали их белком, после чего перепрограммировали в нейроны. Это один из самых распространенных методов получения нервных клеток для исследований, а сохранение метилирования в процессе дифференцировки — важное свойство для использования инструмента. Оказалось, нейроны действительно сохранили метильные метки на выбранных учеными генах.