В будущем новая экспериментальная конструкция TPM позволит фиксировать быстрые биологические процессы и может значительно улучшить наше понимание их. Объединив два режима лазерного сканирования, исследователи разработали универсальную систему двухфотонной микроскопии, которую можно использовать для наблюдения за чрезвычайно быстрыми биологическими процессами с высокой частотой кадров и пространственным разрешением.

Двухфотонная микроскопия (two-photon microscopy, TPM) произвела революцию в области биологии, позволив исследователям наблюдать сложные биологические процессы в живых тканях с высоким разрешением. В отличие от традиционных методов флуоресцентной микроскопии, TPM использует низкоэнергетические фотоны для возбуждения флуоресцентных молекул для наблюдения. Это, в свою очередь, позволяет проникать в ткань намного глубже и гарантирует, что флуоресцентные молекулы или флуорофоры не будут постоянно повреждены возбуждающим лазером.

Однако некоторые биологические процессы происходят слишком быстро, чтобы зарегистрировать их даже с помощью самых современных TPM.

Есть один из конструктивных параметров, ограничивающих производительность TPM — частота строчной развертки, измеряемая в кадрах в секунду (frames per second, FPS). Это относится к скорости, с которой образец-мишень можно просканировать лазером в одном направлении (например, при горизонтальной прокрутке). Низкая частота сканирования также влияет на общий FPS системы, поскольку определяет, насколько быстро лазер перемещается в другом направлении, т. е. в вертикальном направлении. Вместе они создают компромисс между временным разрешением микроскопа и размером кадра наблюдения.

Чтобы решить эту проблему, международная группа исследователей из Китая и Германии разработала мощную установку TPM с беспрецедентно высокой частотой линейного сканирования. Согласно отчету, опубликованному в журнале Neurophotonics, эта система микроскопии была разработана для визуализации быстрых биологических процессов с высоким временным и пространственным разрешением.

Одним из ключевых факторов, отличающих предлагаемые TPM от традиционных, является использование акустооптических дефлекторов (acousto-optic deflectors, AOD) для управления сканированием возбуждающего лазера. AOD — это особый тип кристалла, показатель преломления которого можно точно контролировать с помощью акустических волн, перенаправляя через него лазерный луч. Также они обеспечивают более быстрое лазерное управление, чем это достигается с помощью гальванометров, используемых в обычных TPM.

Соответственно, ученые разработали специальный AOD, используя кристалл диоксида теллура (TeO₂), достигнув высокой частоты линейного сканирования. С этим кристаллом лазер сканировал строку в кадре всего за 2,5 микросекунды, что соответствует максимальной частоте сканирования строки 400 кГц. Точно так же исследователи использовали AOD для достижения разумной низкой частоты сканирования в другом направлении.

Объединив два режима лазерного сканирования, исследователи разработали универсальную систему двухфотонной микроскопии, которую можно использовать для наблюдения за чрезвычайно быстрыми биологическими процессами с высокой частотой кадров и пространственным разрешением. Авторы и права: Нейрофотоника (2023 г.) DOI: 10.1117/1.NPh.10.2.025006

Чтобы еще больше улучшить адаптируемость микроскопа, ученые добавили возможность переключения на механизм лазерного сканирования на основе гальванометра, когда это необходимо. Это позволило сканировать большие области образца с приемлемым разрешением и скоростью, упрощая поиск небольших областей интереса перед переключением на сканирование AOD.

Команда провела несколько экспериментов по проверке концепции с недавно разработанным TPM. Так, им удалось точно измерить скорость распространения кальция в дендритах нейронов мозга мышей, а также визуализировать траекторию отдельных эритроцитов в кровеносных сосудах.