«Системный подход» к живому

Развитые страны, переживающие очередную технологическую — уже нанотехнологическую — революцию, уделяют развитию биотеха особое внимание. Биотехнологии — тот инструмент, с помощью которого могут быть разработаны принципиально новые персонифицированные лекарственные средства. Они могут обеспечить здоровье нации, её биобезопасность, стать надёжным источником патентоспособных технологий.

Вадим Маркович Говорун, заместитель директора по научной работе ГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава, доктор биологических наук, профессор, член редколлегии журнала «Российские нанотехнологии», ответственный редактор по направлению «Нанобиология»

Новейшие отрасли биотехнологий позволят в перспективе решать многие социальные и экономические задачи, стоящие перед современным обществом. Эта область исследований может стать надёжным источником патентоспособных технологий, приносящих прибыль государствам и частным компаниям. Она будет способствовать развитию научно-технического потенциала, обеспечивающего здоровье нации, её биобезопасность, контроль за распространением инфекционных и соматических заболеваний.

Биотехнологии — тот инструмент, с помощью которого могут быть разработаны принципиально новые персонифицированные лекарственные средства, позволяющие, как декларировал когда-то Гиппократ, лечить не болезнь, а больного.

Вот почему развитые страны, переживающие очередную технологическую — уже нанотехнологическую — революцию, уделяют развитию биотеха особое внимание.

О том, что происходит в бурно развивающейся области нанобиотехнологий, рассказывает заместитель директора по научной работе ГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава профессор Вадим Говорун.

Сегодня мы становимся свидетелями стремительного развития биотехнологий, идущего сразу в нескольких направлениях.

• Во-первых, значительно усовершенствованы технологии определения структуры биополимеров. Оказывается, возможно «читать» и анализировать биологические тексты (определение нуклеотидной последовательности ДНК, установление аминокислотной последовательности белков). Это позволило к настоящему времени практически полностью расшифровать генетическую информацию, заключённую в геноме человека, а также в геномах основных патогенных и многих промышленно значимых микроорганизмов и вирусов (продуцентов, векторных систем и т.д.). Следовательно, создаются уникальные предпосылки для разработки новых технологий лечения и профилактики заболеваний. В обозримом будущем можно будет говорить о создании персонализированной медицины.
• Во-вторых, информатизация исследований позволяет, по существу, говорить о переходе от медицинского эмпиризма к прагматизму, от перебора множества лекарственных соединений в ходе экспериментов к целенаправленному созданию соединений с заранее заданными свойствами. Теперь можно in silico придумывать и производить новые типы терапевтических средств.
• Наконец, ещё одна принципиально важная особенность — миниатюризация устройств и материалов, используемых в биомедицинских исследованиях. Появляется возможность одновременно измерять большое количество параметров изучаемых объектов.

Происходит постепенный переход исследований из микромира в наномир, в масштабы, характерные для размеров отдельных молекул. В конечном итоге благодаря уменьшению размеров измерительных устройств, окажется возможным определять не концентрацию молекул в исследуемом образце, а их количество.

В целом же можно говорить о появлении не только новых знаний и навыков, но и целой области — нанобиотехнологии. Специалисты, работающие в ней, используют фундаментальные знания, накопленные в предыдущие периоды развития науки, для конструирования аналогов живых объектов или их частей и для придания им свойств, сравнимых или превосходящих по своим характеристикам живые системы.

Нанобиотехнологии — междисциплинарная область, но главная их составляющая — медицинская. Это и создание новых систем диагностики и контроля, необходимых, например, для проведения адекватной, более того, персонализированной терапии; и разработка новых лекарственных соединений и систем адресной доставки лекарств.

Реальностью становится и создание новых биосовместимых материалов, с помощью которых будет возможно замещать повреждённые ткани и органы. Поэтому одна из основных целей нанобиотехнологий — копирование известных, изученных макромолекул и молекулярных комплексов или их функций, что позволит восполнять дефекты, накапливающихся в процессе жизнедеятельности сложной биологической системы. Отработавшие свой срок биоструктуры могут быть замещены искусственными. Можно будет выборочно удалять патологически изменённые биоструктуры для предотвращения процессов деградации, малигнизации и обструкции органов и тканей.

Нано-био-тех: три пути

Можно выделить три главных направления развития современных нанобиотехнологий.

• Первое, нанобиотехнологии живых систем, подразумевает придание живым системам (прежде всего микроорганизмам) путём направленной модификации свойств, необходимых для обеспечения определённой функции (или даже технологического цикла при создании полностью искусственных наноконструкций). К этому же направлению относится использование микроорганизмов как продуцентов наноматериалов.
• Второе направление — «полусинтетические» нанобиотехнологии. Здесь речь идёт об использовании биополимеров: белков, нуклеиновых кислот, других молекул и их комплексов для создания различных нанобиотехнологических устройств (биомоторов, пор, сенсоров). Далее с использованием принципов самосборки или синтеза органических и неорганических молекул могут быть созданы устройства, выполняющие строго определённые функции копируемой биологической структуры. Возможно и создание биокомпьютеров на основе процессов самосборки макромолекул. Такие биокомпьютеры можно будет применять для диагностики заболеваний.
• Наконец, третье направление — «синтетические» нанобиотехнологии, предшественницы технологий создания устройств, предназначенных для исправления молекулярных ошибок и первичной диагностики состояния организма, тканей, клеток. Тут предполагается использование явления самосборки или синтеза органических и неорганических молекул для создания устройств из многочисленных атомов, упорядоченных друг относительно друга.

Живая электроника

— Если говорить подробнее об использования живых объектов в нанобиотехнологических целях, то прежде всего надо упомянуть о технологии получения в естественных биореакторах — бактериальных клетках — различных наночастиц (магнитных, квантовых точек и других). Например, клетки магнетотактильных бактерий Magnetospirillum magneticum могут синтезировать частицы магнетита — Fe3O4, причём, что любопытно, размеры наночастиц зависят от условий культивирования бактерий. Важно и то, что такая «продукция» бактериальных клеток окружена мембраной, поэтому частицы магнетита легко выделять из раствора. К настоящему времени уже определены последовательности генов Magnetospirillum magneticum, ответственных за синтез наночастиц, так что, используя методы генной инженерии, можно направленно влиять на параметры получаемых наночастиц.

Такие частицы могут применяться в самых разных методах: например, в диагностикумах с использованием иммунохимии, в системах разделения клеток — клеточной сепарации, выделения нуклеиновых кислот, контроле за адресной доставкой лекарств, локальной гипертермии. Кроме того, возможно применение таких наночастиц для целей атомно-силовой микроскопии.

Это не единственный пример синтеза наночастиц in vivo. Сейчас возможно получать бактериальным синтезом наночастицы, состоящие из таких металлов, как кадмий и лантан (что, в свою очередь, может обеспечить прорыв в технологии создания компонентов микроэлектронных устройств — прим. STRF.ru). В качестве нанобиореактора используются и дрожжевые клетки. Например, в клетках дрожжей Schizosaccharomyces pombe формируются металл-пептидные комплексы — микрокристаллины с размером чуть меньше двух нанометров, фактические квантовые точки, которые могут применяться в полупроводниковых устройствах.

Наконец, синтез наноструктур может происходить и в растворе с использованием компонентов клеточной стенки бактерий. В данном случае речь идёт о применении белковых молекул, составляющих так называемые S-слои — регулярные структуры на поверхности бактерий. Уже описаны результаты работ по созданию in vitro мембран, состоящих из белков S-слоёв, и имеющих контролируемый размер пор. Примечательно, что такие структуры могут включать в себя молекулы «гостей», встраиваемые внутрь пор.

Конечно, нанобиотехнологи используют не только отдельные молекулы, но и крупные молекулярные ансамбли (к примеру, вирусы), формирующиеся путём самосборки. Классический пример — вирус табачной мозаики, издавна один из излюбленных объектов вирусологов. Он представляет собой симметричный палочковидный белковый капсид (цилиндр), состоящий из более чем двух тысяч одинаковых белковых молекул, уложенных по спирали. Внутри вирусного капсида имеется полость, в которой размещена молекула рибонуклеиновой кислоты. Такие вирусные структуры могут применяться в качестве наноконтейнера для других наночастиц, прежде всего металлов; использоваться как матрица (или «скелет») для формирования на их поверхности путём декорирования металлических нанопроводов. Как следствие, они могут служить в качестве наноэлектродов, находить применение в микроэлектронике.

Вадим Говорун: «Биотехнологии — тот инструмент, с помощью которого могут быть разработаны принципиально новые персонифицированные лекарственные средства, позволяющие, как декларировал когда-то Гиппократ, лечить не болезнь, а больного»

А как новые технологии применяются для доставки лекарственных соединений?

— Здесь речь идёт о везикулярных наносистемах — это частицы (липосомы, мицеллы) или молекулы (фуллерены и дендримеры). Наиболее хорошо изучены мицеллы и липосомы, они довольно давно используются для решения прикладных и фундаментальных задач. Стабилизированные мицеллы размером 5—50 микрон, состоящие из природных или искусственных фосфолипидов, применяются в качестве средств доставки лекарственных соединений к клеткам-мишеням. Такие частицы обладают высокой растворимостью и легко проникают через гисто-гематические барьеры, делая возможной доставку лекарств в различные ткани и органы. Иногда структурные блоки, используемые для производства мицелл, имеют выраженный терапевтический (антибактериальный, противовирусный и фунгицидный) эффект и, следовательно, могут использоваться как антибиотики нового поколения.

Использование наноструктур для доставки лекарств представляется очень перспективным. Однако существуют опасения, что применение новых методик будет сопряжено с риском для здоровья людей…

— Безусловно, требуется развитие новых алгоритмов тестирования подобного рода средств, потому что в отличие от диагностики (которая по крайней мере происходит вне тела человека), никто досконально не изучал аспекты, связанные с безопасностью, применительно к лекарствам нового поколения. Возможно, это излишние переживания и страхи. Но, может статься, использование наночастиц, дендримеров, других носителей лекарственных агентов способно вызывать серьёзные осложнения. Пока что не существует ни метрологической, ни фармакологической базы, чтобы всё это испытывать.

Мотор из молекул

Перейдём к «полусинтетической» биологии. Что можно сказать о биополимерах как своего рода «строительных блоках» для новых устройств?

С этой точки зрения наиболее важны два основных класса биополимеров — белки и нуклеиновые кислоты.

Белки интересны прежде всего потому, что они — основные компоненты молекулярных машин, структура и функции которых «оттачивались» в ходе сотен миллионов лет эволюции. В качестве примера «молекулярных моторов» следует привести АТФ-синтазу и флагеллярные жгутики бактерий, обеспечивающие вращательное движение. Поступательное, линейное движение — прерогатива таких белков, как миозин и кинезин. А исследователи уже умеют «включать» и «выключать» работу подобных моторов, например, тех же бактериальных жгутиков.

Что касается нуклеиновых кислот, то главная их особенность, связанная с функционированием и в живых клетках, и в нанобиотехнологических приложениях, — способность к взаимному узнаванию, комплементарным взаимодействиям их цепей. Действительно, привлекательность молекул нуклеиновых кислот заключена, в том числе, в высокой степени комплементарности: предел взаимного узнавания цепочек ДНК составляет три ангстрема — это очень большая точность.

Принцип комплементарности — фундаментальный для работ по созданию наноконструкций на основе молекул нуклеиновых кислот. Молекулы ДНК или их фрагменты могут быть использованы как строительный материал для нанофабрик будущего. Подобные «строительные блоки» позволят не только создавать планарные структуры определённой формы и размера, но и перейти к проектированию и созданию объёмных наноконструкций.

Диагностика с помощью биокомпьютера

Диагностика — одно из тех направлений, где с развитием биотехнологий ожидаются очень серьёзные изменения…

— Вообще говоря, диагностика в широком смысле является неотъемлемой частью любого технологического процесса — будь то сборка наноустройств, лечение пациентов, создание лекарственных препаратов. Неудивительно, что миниатюризация диагностических устройств и появление у них новых свойств — многопараметричности, привели к стабильному росту интереса рынка диагностикумов к нанотехнологиям. В процесс создания новых методов и устройств, предназначенных для диагностики, вовлекаются и смежные технологии — микрофлюидные технологии, микро- и наноэлектроника, зондовая микроскопия, техника спектрального анализа единичных молекул.

Каковы будут конкретные приложения новых технологий детекции?

— Пожалуй, наиболее характерный пример — создание новых технологий секвенирования молекул ДНК. Быстрые, экономичные и, главное, достоверные способы определения последовательностей нуклеотидов в их составе нужны как медикам, так и специалистам по генотипированию организмов, криминалистам и так далее.

Существующие в настоящее время способы секвенирования молекул ДНК обладают недостатком, связанным с тем, что на определённом этапе требуется амплифицировать, «размножить» молекулы нуклеиновых кислот с помощью полимеразной цепной реакции. Но дело в том, что фермент ДНК-полимераза, осуществляющий синтез новых цепочек молекулы ДНК, совершает ошибки, накапливающиеся в процессе амплификации. Каким образом обойти эти затруднения? Очевидно, что требовалось разрабатывать прямые, нехимические способы расшифровки нуклеотидной структуры молекул ДНК.

Из числа новых методик в первую очередь следует назвать секвенирование с помощью нанопор. Концепция использования небольших по своим размерам отверстий — пор — была развита в компании Coulter, которая использует поры для подсчёта частиц от субмикронного до миллиметрового размера. Регистрация молекул ДНК происходит следующим образом. Молекулы суспендированы в растворе электролита, разделённом на два резервуара. На стенки канала, соединяющего резервуары, подаётся заданное напряжение, и молекулы нуклеиновых кислоты начинают проходить через канал. Когда отдельная молекула входит в канал, в нём возрастает электрическое сопротивление, по изменению тока и осуществляется регистрация каждой новой молекулы.

В настоящее время существует два подхода:

• использование пор из молекул белка (например, α-гемолизина) и
• создание неорганических пор с большим временем жизни.

Основная цель разработчиков новых технологий секвенирования молекул ДНК (её пока не удаётся достичь) — научиться распознавать отдельные нуклеотиды в составе молекулы ДНК или РНК. Идея исследователей состоит в том, что электрические характеристики при прохождении через канал разных нуклеотидов будут отличаться. Понятно, что требуется минимизировать длину канала для обеспечения высокого разрешения. Однако достичь необходимой стабильности канала существующими технологическими приёмами невозможно. Эта разработка потребует новых усилий — в частности, создания методов формирования пор в ультратонких (толщиной два-три нанометра) плёнках.

Следующая область диагностики — нанопротеомика. Собственно, термин «нанопротеомика» был впервые предложен нашим соотечественником — профессором Александром Арчаковым, он означал использование метода атомно-силовой микроскопии для идентификации отдельных белковых молекул или их комплексов. Согласно идеям Александра Арчакова и соавторов, молекулярная диагностика должна быть сопряжена с определением единичных белковых молекул, а не их концентрации в исследуемом образце. Действительно, существует принципиальная возможность визуализации не только белковых комплексов, но и отдельных макромолекул на подложке. И несколько компаний разрабатывают многоканальные атомно-силовые микроскопы и специальные модифицированные подложки для определения вирусов, бактерий, токсинов и антигенов.

Основным недостатком такого подхода является отсутствие специфических признаков получаемого образа, что иногда драматически влияет на точность или специфичность при определении аналита. Но техника микроскопии тоже не стоит на месте, наряду с совершенствованием методов туннельной микроскопии, активно развиваются иные направления нанопротеомики, предназначенные для решения исследовательских и медицинских задач.

Ещё одна сфера приложения нанопротеомных технологий — разделение смесей белков и пептидов с последующим масс-спектрометрическим анализом. Наночастицы металлов (оксида алюминия, кремния) и синтетические наночастицы применяются в исследовании процессов разделения модельных смесей пептидов и белков. По данным авторов этих работ, нанохроматография существенно, почти на порядок, улучшает разделение и позволяет добиться лучших результатов протеомного анализа по идентификации пептидов и целых белков в ходе дальнейшего масс-спектрометрического анализа.

Системы детекции становятся всё более миниатюрными. Вероятно, со временем можно будет создать устройства, способные определять параметры жизнедеятельности даже одиночной клетки?

— На сегодняшний день это невозможно, однако многие технологические элементы, которые используются для создания современных диагностических систем, уже выглядят как реальные прототипы будущих наноустройств, предназначенных для практики.

Например, микро- или нанофлюидные биоаналитические системы, сочетающие в своём составе элементы электроники, микромеханики, оптики и гидравлики. Основа таких систем — стеклянная или полимерная пластина с многоуровневой системой каналов, микрореакторов, клапанов и насосов, оперирующая с микро-, нано- и фемтолитровыми объёмами жидкости. Микрофлюидные системы позволяют работать с индивидуальными клетками на разных стадиях их развития. Радикальная миниатюризация размеров экспериментальных устройств, достигаемая с использованием микро- и нанофлюидных технологий, даёт возможность перейти к качественно новым, менее дорогим методам решения широкого круга фундаментальных и прикладных задач молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии и биомедицины.

Что делают «нано-» в «био-»

А что можно сказать о таких материалах, как фуллерены и нанотрубки? Каково их место в области «нанобио»?

— Они являются наноконтейнерами для различных органических соединений, проявляющих противовирусную, противораковую и антибактериальную активность. Выше я упоминал, что мицеллярные системы с модифицированными фосфолипидами могут быть использованы как антибактериальные препараты нового поколения. Подобная антибактериальная, антираковая активность свойственна и фуллеренам. Например, фуллерен С60 был применён для лечения вирусной инфекции и онкологических заболеваний у животных.

Уникальные свойства фуллеренов обусловлены их высокой реакционной способностью за счёт большого количества свободных валентностей углерода. Для применения в биомедицине чистые фуллерены малопригодны в силу их нерастворимости в водных растворах и, как следствие, ограничений по используемым концентрациям в исследовании их свойств на животных.

Однако, функционализация фуллеренов (например, получение карбоксифуллеренов) делает эти соединения биодоступными и, следовательно, более эффективными для исследований в биосистемах. Один из способов введения фуллеренов в организм — инкапсуляция в липидную везикулу для адресной доставки к трансформированным клеткам. Использование принципов фотодинамической терапии и генерирование синглетного кислорода фуллереном под действием света вызывает повреждение и гибель клетки-мишени.

И всё же основные направления использования углеродных нанотрубок в биологии и медицине сопряжены с их уникальными механическими и электрическими свойствами. Уже освоены технологии иммобилизации ферментов и даже ферментативных комплексов, являющихся аналитическим элементом нанобиосенсора на внутренней и внешней стороне нанотрубки. Работа фермента с определённым субстратом (например, использование глюкозооксидазы) позволяет создать высокочувствительный сенсор, измеряющий концентрацию глюкозы.

Описаны различные биохимические сенсоры для определения отравляющих веществ, катионов и анионов, антигенов болезнетворных вирусов и бактерий, а также прионовых белков. Нанотрубки используются для обеспечения адресной доставки лекарственных соединений, макромолекул (белков, ДНК) к клеткам-мишеням. А комбинация нанотрубок с наночастицами из оксидов металлов служит подложкой в культивировании клеток и создании прототипов органов и тканей.

Кроме того, активно разрабатываются бионаносенсоры с использованием функционализированных нанотрубок и металлических нанопроводов. Подобные проекты подразумевают иммобилизацию молекул-датчиков (ферментов, антител, лектинов и т.д.) для создания многопараметрического биосенсора, совместимого с тканями организма или клетками в культуре.

Технологии ближайшего будущего

Как Вы считаете, какие условия будут способствовать развитию нанобиотехнологий в России в ближайшем будущем?

— Быстрое развитие нанобиотехнологии и смежных нанотехнологических дисциплин обуславливает вовлечение новых исследовательских групп и целых институтов в эти исследовательские программы. Большинство нанобиотехнологичеких проектов находятся сейчас на стадии инициации или получения первых результатов. Однако инструментарий, идеология и технология «нанобио» уже сформированы.

Как это нередко бывает в современных технологических дисциплинах, процессы, происходящие в разных лабораториях и компаниях, взаимодействуя друг с другом, начнут в ближайшее время давать первые практические результаты. Появление на коммерческом биотехнологическом рынке новых систем для определения нуклеотидной последовательности ДНК, нанодозаторов, микрофлюидных лабораторий знаменует постепенный переход биотехнологий в другой формат исследований и неизбежно даст иное качество получаемых результатов.

Стоит подчеркнуть, что усложнение технологий, их комплексность, требуют чёткой кооперации различных исследовательских групп для достижения поставленной цели.

Нанобиотехнологии, повторю, — мультидисциплинарная наука, участие единичной исследовательской лаборатории в этом процессе оказывается малоэффективным. Фактически, речь идёт о создании технологических платформ — совокупностей идей, компетентных специалистов, материально-технического оснащения, которые действуют на стыке разных дисциплин. Поэтому, например, неслучайно участие в нанобиотехнологических проектах коллективов, которые разрабатывают концепцию системной или синтетический биологии. В конечном же счёте, объём и качество накапливаемых в ходе системных биологических исследований знаний обусловят прогресс в нанобиотехнологиях.

http://www.strf.ru/material.aspx?…

Ну, прямо целый трактат по заданной теме. И, с одной стороны, очень интересно… Но, с другой, сколько же нужно знать (я уж не говорю о специальной терминологии), чтобы понимать и воспринимать все эти утверждения. Я думаю, что этот материал будет полезен в первую очередь для специалистов, как уже сложившихся, так и только начинающих овладевать этой профессией. Пожелаем же им успехов в освоении и использовании методов нового научно-технического направления, разитие которого, несомненно, принесёт большую пользу людям…