Ученые разработали новое приспособление для изучения биохимических процессов

Фундаментальные исследования в области геномики и протеомики создают платформу для наукоемкой разработки лекарств и повышения эффективности лечения заболеваний. Значительная часть таких исследований направлена на изучение состояния молекул ДНК или белков в условиях эксперимента. Задачу этих экспериментов можно сравнить с приманиванием конкретной рыбы в большом океане, и в научной методологии существует целое направление, основанное на таком подходе и называемое иммобилизацией. Методы исследования с применением иммобилизации направлены на исследование конкретных молекул, связываемых с поверхностью и удаляемых из исходного объема образца для детекции.

Основные трудности, с которыми сталкиваются исследователи в применении иммобилизации биологических молекул, являются сохранение структуры и функциональной активности связанных с поверхностью молекул, а также влияние фонового сигнала, определяемого природой самой поверхности.

Работа над улучшением качества данных, получаемых с помощью методов иммобилизации, привела ученых к созданию новой методологической платформы, основанной на применении углеродных нанотрубок в качестве сорбирующей поверхности. Новый метод позволит связывать, выделять и анализировать активность очень малого числа исследуемых молекул.

Уникальные особенности нового подхода заключаются в возможности быстрого сорбирования нескольких молекул в определенной области образца, простое выделение связанных молекул с сохранением их конформации и активности, а также четкое положение этих молекул на иммобилизующей поверхности. «Все это позволяет проводить быстрый и чувствительный анализ в режиме реального времени», – комментирует автор работы, профессор Brown University в Род-Айленде (США) Анубхав Трипати (Anubhav Tripathi).

Наноиголки – это ультратонкие устройства, состоящие из нескольких нанотрубок. Толщина острия наноиголки определяется диаметром нанотрубки и составляет примерно 1 нм, что сравнимо с размерами биологических молекул.

Использование нанотрубок в качестве связывающей поверхности для биологических молекул позволяет поддерживать их нативную (природную) конформацию, и таким образом, проявлять реальную активность в экспериментах. «Благодаря природным связям в углеродных нанотрубках, процесс связывания хорошо описывается в рамках современных знаний биохимии. Пространство, в котором может связаться молекула с наноиголкой настолько мало, что мы выделяем считанное количество молекул. После связывания в образце иголка может быть удалена из среды и перенесена в другой раствор, что позволяет добиться высокого соотношения сигнал/фон и при этом детектировать очень небольшое количество молекул», – поясняет Трипати.

Работа, демонстрирующая возможность применения наноиголок в биохимической практике, опубликована недавно в журнале Langmuir («Nanoneedle Method for High-Sensitivity Low-Background Monitoring of Protein Activity»).

Наноиголка, состоящая из углеродных нанотрубок, на своем острие имеет открытые концы нанотрубок. Хотя ученые не исключают возможность сорбции белков на дефектах нанотрубок, наиболее вероятным местом соединения биологических молекул с нанотрубками являются именно их открытые концы. Для исключения неспецифического связывания на дефектах стенок нанотрубок наноиголку достаточно покрыть блокирующим агентом.

Схематическое изображение (не в масштабе) связывания белка с острием наноиголки. Важно отметить здесь, что 15-нанометровое острие построено из нескольких одностеночных углеродных нанотрубок, каждая из которых имеет диаметр около 1 нм. Поэтому такое острие обеспечивает точечные контакты исследуемых молекул с наноиголкой. Например, размер молекулы щелочной фосфатазы составляет примерно 5 нм

Количество иммобилизованных на наноиголке белков можно варьировать, изменяя время сорбции или концентрацию исходного раствора, также можно подавать небольшое напряжение на острие иголки. Хотя теоретическое количество иммобилизованных молекул щелочной фосфатазы можно понизить до единичных молекул, в данной работе ученые оказались ограничены чувствительностью флуориметра и временем конформационной устойчивости фермента. Вместе с тем, подход с использованием иммобилизующих нанотрубок перспективен для изучения кинетики ферментативных реакций.

«Быстрый, простой, недорогой и чувствительный способ изучения белков и нуклеиновых кислот  – это одно из будущих применений наноиголок, – комментирует Трипати. – Ученые верят, что наноиголки раскроют и другие новые подходы в исследованиях биологических систем».

Мария Костюкова